(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201580034585.1
(22)申请日 2015.04.30
(30)优先权数据
14166535.6 2014.04.30 EP
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2016.12.26
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/EP2015/059560 2015.04.30
(87)PCT国际申请的公布数据
WO2015/166072 EN 2015.11.05
(71)申请人 诺和诺德股份有限公司
地址 丹麦鲍斯韦
(72)发明人 O.E.詹森 P.卡尔斯加亚尔德
(74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公司 72001代理人 李唐 罗文锋(51)Int.Cl.C07K 1/22(2006.
01)C07K 16/00(2006.01)C07K 16/06(2006.01)B01D 15/12(2006.01)B01D 15/20(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
使用酸性pH下的辛酸。该方法包括作为层析步骤
一部分的辛酸处理，以便在没有不连续过程并且
不需要人员关注的情况下进行病毒灭活，特别是
在洗脱物的pH调节通过将其洗脱至缓冲液中而
自动进行的情况下。本发明的方法进一步导致支
原体灭活和杂质如宿主细胞蛋白质
(HCP)减少。权利要求书1页 说明书16页CN 106459142 A 2017.02.22
C N 106459142
A
1.一种从样品中纯化目标蛋白质的方法，其包括以下步骤：
i.将含有蛋白质的样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固定相；
ii.使具有结合的目标蛋白质的固相接触辛酸溶液；其中该辛酸溶液处于允许形成游离辛酸的pH下，并且其中如针对游离辛酸所测量的，该辛酸溶液是浓度为1至50mM的辛酸缓冲液；以及
iii.洗脱所述目标蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中目标蛋白质的纯化包括所述样品中病毒的灭活。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其用于无病毒蛋白质溶液的制备。
4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述辛酸溶液包含一定比例的i)辛酸盐和ii)无机或有机酸的组合，从而提供这样一种溶液：其pH低于7.0，如6.5或更低，并且如针对游离辛酸所测量的，其辛酸浓度为至
少1mM，如至少2mM，如2至10mM的浓度。
5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述蛋白质选自抗体或其片段，凝血因子如FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI和FVIII，以及生长激素。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品选自发酵液、细胞培养物、细胞系培养基、腹水、组织培养基、转基因细胞培养基、包含血浆成分的人类或动物血浆。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述固定相是层析柱。
8.根据权利要求7所述的方法，其中将所述样品加载至选自离子交换层析柱、亲和层析柱、混合模式层析柱、快速蛋白质液相层析柱和膨胀床吸附(EBA)层析柱的固定相上。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述辛酸溶液具有将所述病毒灭活而不使所述目标蛋白质变性的pH。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中辛酸溶液的pH为6.1或更低，如2-6，如pH为2＜pH≤6，优选3＜pH≤6，更优选4＜pH≤6，如4.5＜pH≤6，如4.6≤pH＜6，如约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8和约
5.9，如4.9＜pH＜6。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中辛酸溶液是一种辛酸缓冲液，如针对游离辛酸所测量的，其浓度为1至20mM，如2至20mM或1至10mM，更优选2至10mM如2至8mM，如2至6mM。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包含有包膜病毒、无包膜病毒、或无包膜病毒和有包膜病毒两者。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其为自动化的，或是自动化蛋白质纯化过程的一部分。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步将支原体灭活。
15.一种用于纯化选自凝血因子、抗体或其Fab的蛋白质的方法，其包括以下步骤：i.将包含一种或多种所述蛋白质的样品加载至用于亲和层析的固定相上；
ii.使固相接触pH为4.9＜pH＜6.2的、如针对游离辛酸所测量的2至10mM如2至8mM，如2至6mM的辛酸溶液，以便灭活并洗掉病毒；
iii.洗脱所述目标蛋白质。
权 利 要 求 书1/1页CN 106459142 A
使用辛酸纯化蛋白质的方法
技术领域
[0001]使用辛酸进行使病毒灭活或去除的蛋白质纯化。
[0002]背景
[0003]生物药物或使用包含性蛋白质的药物组合物疾病、病症或状况是许多制药和生物技术公司的战略要素。生物药物组合物中使用的许多蛋白质通过使用哺乳动物细胞系进行重组生产或通过从生物流体中纯化而获得。然而，通过这样的方法制备的性蛋白质可能被病毒污染，表面上带有传染性致病病毒，这可能对个体的健康有害。有必要对包含性蛋白质的介质进行处理以消除任何潜在的污染的病毒的活性。
[0004]传染性致病病毒的灭活可通过热灭活、溶剂/去污剂(S/D)灭活、pH灭活、化学灭活和/或辐照灭活来进行，其中S/D灭活可能是最广泛接受的可靠方法。
[0005]大多数人类病原体是有包膜病毒。这些病毒对由溶剂和去污剂引起的膜破裂敏感。采用热、酸性pH、化学品和辐照的灭活方法是有问题的，因为这些手段是刺激性和/或侵入性的，并且倾向于使被纯化的性蛋白质变性或以其它方式失活。
[0006]对于病毒的灭活，作为药物产品纯化过程中病毒清除的一部分，通常通过去污剂或低pH处理步骤
将有包膜病毒灭活，在该步骤中向药物产品的溶液添加去污剂或将其pH调节至约3.7(3.5-3.9)持续长达6小时或更久。然而，去污剂并不总是对所有种类的有包膜病毒都有效，它们可能具有环境问题，或者对于低pH灭活而言，因为当pH高于3.8时灭活效应逐渐消失，所以操作窗口非常窄。相反，当pH值低于3.5时，许多蛋白质的聚集体形成或变性风险急剧增加。
[0007]EP 0 374 625已经表明，辛酸在短时间内对大多数有包膜病毒是有效的。US 4, 939,176报道了一种通过使生物活性蛋白质的溶液与辛酸接触来灭活该溶液中的病毒的方法。针对该方法所记载的优选条件是pH 4至pH 8，以及0.07(％w/w)至0.001(％w/w)的非电离形式的辛酸。
[0008]利用化学剂的其它病毒灭活方法是已知的。US 4,540,573教导了使用二烷基磷酸酯或三烷基磷酸酯作为抗病毒剂。US 4,534,972描述了一种使得活性或免疫活性蛋白质溶液基本上不含病原体的方法。在US 4,534,972中，将蛋白质溶液与诸如菲咯啉铜等过渡金属络合物和还原剂接触，以在基本上不影响蛋白质活性的情况下实现病毒的灭活。[0009]US 5,164,487涉及使用辛酸制备不含聚集体、血管活性物质和蛋白水解酶的IgG 制剂。该方法包括在用离子交换或疏水性基质进行层析纯化之前使含有IgG的起始材料与0.4％至1.5％的辛酸接触。
[0010]Steinbuch等人显示了使用辛酸来沉淀存在于Cohn乙醇级分III中的大多数蛋白质和脂蛋白(除了免疫球蛋白以外)(Steinbuch等人，1973)。已经描述了免疫球蛋白从哺乳动物血清和腹水中的两步纯化(Mc
Kinney等人，1987)。首先使用辛酸来沉淀白蛋白和其它非IgG蛋白质，然后将硫酸铵添加至上清液中以使IgG沉淀。
[0011]在人免疫球蛋白制备过程中，通常认为只要优化了诸如温度和离子强度等参数，在pH 4.8下辛酸是大多数血浆蛋白质的有效沉淀剂。Steinbuch等人(1969)已经描述了用
辛酸沉淀大部分血浆蛋白质，而不影响IgG、血浆铜蓝蛋白和IgA。Steinbuch等人使用辛酸从哺乳动物血清中分离了IgG，并且报道，在微酸性pH但不低于pH 4.5时，最佳地获得了大量的非免疫球蛋白沉淀。将血浆用pH 4.8的0.06M乙酸盐缓冲液2∶1稀释，然后用2.5wt.％辛酸盐处理以启动沉淀。
[0012]概述
[0013]本发明提供了一种从样品中纯化目标蛋白质的方法，其包括以下步骤：[0014]i.将含有蛋白质的样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固定相；[0015]ii.使具有结合的目标蛋白质的固相接触辛酸溶液；其中该辛酸溶液处于允许形成游离辛酸的pH下，并且其中如针对游离辛酸所测量的，该辛酸溶液是浓度为1至50mM的辛酸缓冲液；以及
[0016]iii.洗脱所述目标蛋白质。
[0017]本发明最终实现引入辛酸处理作为层析步骤的一部分，以便在没有不连续过程并且不需要人员关
注的情况下进行病毒灭活，特别是在洗脱物的pH调节通过将其洗脱至缓冲液中而自动进行的情况下。
[0018]本发明的一个方面涉及一种从样品中纯化目标蛋白质的方法，其包括以下步骤：[0019]i.将含有蛋白质的样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固相；[0020]ii.使所述固相接触辛酸溶液；以及
[0021]iii.洗脱所述目标蛋白质。
[0022]本发明的又一方面涉及一种含有蛋白质的混合物中的病毒的灭活方法，其包括以下步骤：i.将样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固相；ii.使所述固相接触辛酸溶液，以便灭活并洗掉所述病毒；以及iii.洗脱所述目标蛋白质。
[0023]本发明的另一方面涉及一种制备无病毒蛋白质溶液的方法，其包括以下步骤：i.将样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固相；ii.使所述固相经历辛酸溶液洗涤，以便灭活并洗掉所述病毒；以及iii.洗脱所述目标蛋白质。
[0024]本发明的备选方面涉及一种病毒灭活方法，其中将包含a)目标蛋白质和b)一种或多种病毒类型的样品加载至固定相上，并用辛酸溶液洗涤。
[0025]一种灭活含有脂质外壳的病毒的方法，该方法包括以下步骤：i.将样品加载至固定相上，以使目标
蛋白质结合至所述固相；ii.使所述固相经历辛酸溶液洗涤，以便灭活并洗掉所述病毒；以及iii.洗脱所述目标蛋白质。
[0026]本发明还涉及从包括以下步骤的方法获得的、基本上不含含有脂质外壳的病毒的蛋白质样品：i.将样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固相；ii.使所述固相经历辛酸溶液洗涤，以便灭活并洗掉所述病毒；以及iii.洗脱所述目标蛋白质。
[0027]本发明的再一方面涉及含有蛋白质的混合物中的支原体的灭活方法，其包括以下步骤：i.将样品加载至固定相上，以使目标蛋白质结合至所述固相；ii.使所述固相接触辛酸溶液，以便灭活并洗掉所述支原体；以及iii.洗脱所述目标蛋白质。
[0028]本发明还可解决从示例性实施方案的公开内容中可以明显看出的其它问题。[0029]详述
[0030]本发明的一个方面涉及层析步骤过程中伴行的病毒灭活和蛋白质纯化。本发明的方法不需要技术人员参与灭活步骤以及单独向柱上加载。单一的灭活和捕获步骤可在没有
技术人员参与的情况下进行。
[0031]通常，目标蛋白质的纯化包括对所述样品中的潜在病毒的灭活。因此，本发明的一个方面涉及无病毒蛋白质溶液的制备和根据本发明方法制备的无病毒蛋白质溶液。本发明的方法包括在加载含有蛋白
质的溶液之后并在蛋白质洗脱之前，通过用含有辛酸的洗涤溶剂洗涤层析柱或膜来将病毒灭活。本发明的方法还灭活支原体并导致更大程度的宿主细胞蛋白质(HCP)减少。
[0032]对于本发明的蛋白质纯化和病毒灭活，辛酸溶液必须包含处于其游离酸或非电离酸形式的辛酸；也就是说，基本上作为游离辛酸或非电离辛酸。术语“游离辛酸”和“非电离辛酸”旨在表示处于其非解离形式的辛酸；也就是说，处于其质子化形式；即CH3(CH2)6CO2H。[0033]本发明涉及从包含蛋白质的任何介质或样品中分离或纯化一种或多种目标蛋白质，通常是一种目标蛋白质，该介质或样品可进一步包含、潜在包含或包含一种或多种病毒。该样品可以是粗介质或已经以任何方式部分洗涤、过滤、渗滤(diafiltered)或部分纯化的介质。适当地，该样品选自发酵液、细胞培养物、细胞系培养基、腹水、组织培养基、转基因细胞培养基、人类或动物血液、包含血浆成分的人类或动物血浆。通常，该样品选自细胞系培养基如转基因细胞培养基以及人类或动物血浆。
[0034]所述样品或含有蛋白质的混合物是包含蛋白质的流体，该蛋白质一般是具有生物或活性的蛋白质。流体可以是具有被病毒污染的可能性的任何流体。流体的非限制性实例包括组织和细胞培养提取物，如细胞裂解物、细胞上清液、胎盘提取物或腹水；生物流体，如血液、血浆、血清、乳汁、唾液、精液；或者包含具有活性的蛋白质的任何其它流体，或任何纯化的、部分纯化的此类流体，或包括来自先前纯化步骤的洗脱液的粗液体或胶体。[0035]如上所述，在本发明中使用的样品以细胞系培养基如转基因细胞培养基以及人类或动物血浆作为其来源。
[0036]包含本发明蛋白质的本发明样品可以获自天然表达该蛋白质的生物体，经遗传工程化而表达该蛋白质的转基因生物体，或重组产生该蛋白质的细胞系。转基因生物体的非限制性实例包括本文公开的已被遗传工程化而表达感兴趣的蛋白质的生物体。包含蛋白质的本发明样品可来自生物体或转基因生物体，可使用本领域已知的常规方法从生物流体、组织或器官提取物或生物体的其它来源获得。此外，各种原核和/或真核表达系统也可以是本发明样品的来源，例如用于重组表达本文公开的蛋白质。作为本发明蛋白质的来源的表达系统可以包括但不限于诱导型表达、非诱导型表达、组成型表达、组织特异性表达、细胞特异性表达、病毒介导的表达、稳定整合的表达和瞬时表达。
[0037]本发明的蛋白质可由克隆至表达载体中的多核苷酸编码。原核表达载体、真核表达载体、酵母载体、昆虫载体、哺乳动物载体和其它合适的表达载体是本领域已知并且可商购获得的。
[0038]从生物体、转基因生物体或细胞培养系统初始收获后，包含本发明蛋白质的样品可经历包括渗滤过程的纯化或过滤过程。样品的这种初始或初步纯化可包括样品中蛋白质的浓缩、用于去除杂质的中间纯化步骤和用于去除其他杂质和蛋白质变体的精制步骤(polishing)中的一种或多种。
[0039]本发明的一个目的是灭活含有蛋白质的样品中的病毒。短语“病毒灭活”旨在表示特定样品中病毒颗粒数目的降低(“减少”)，和/或特定样品中病毒颗粒活性的降低，例如但
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