(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610362846.9
(22)申请日 2016.05.26
(71)申请人 西南大学
地址 400715 重庆市北碚区天生路2号
(72)发明人 邹祥 李小东
(74)专利代理机构 北京同恒源知识产权代理有
限公司 11275
代理人 王贵君
(51)Int.Cl.
C07C 69/675(2006.01)
C07C 67/08(2006.01)
C07C 67/54(2006.01)
C12P 7/46(2006.01)
C12R 1/645(2006.01)
(54)发明名称
法
(57)摘要
本发明公开了苹果酸水溶液直接酯化生产
苹果酸酯的方法，具体是将苹果酸水溶液与醇和
80～120℃下酯化反应，反应过程中形成含苹果
酸酯、醇和水的蒸汽混合物，然后将蒸汽混合物
冷却后通入反应容器Ⅱ中，在搅拌下于温度为50
～90℃蒸馏，蒸馏产生的醇蒸汽回流入反应容器
Ⅰ的反应液液面下，循环反应2～10小时后将反应
容器Ⅱ中的产物旋蒸除去醇，残留物经萃取，干
燥，得苹果酸酯；该方法操作简单，条件可控，并
且下游纯化过程中无需中和催化剂，萃取简单，
能大幅降低生产成本，同时能大大提高苹果酸酯
的收率。权利要求书1页 说明书6页CN 106045856 A 2016.10.26
C N 106045856
A
1.苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯的方法，其特征在于，具体步骤如下：将苹果酸水溶液、醇和浓硫酸在反应容器Ⅰ中混合，然后在搅拌、温度为80～120℃条件下酯化反应，反应过程中形成含苹果酸酯、醇和水的蒸汽混合物，再将蒸汽混合物冷却后通入反应容器Ⅱ底部，接着在搅拌、温度为50～90℃条件下蒸馏，蒸馏产生的醇蒸汽回流入反应容器Ⅰ的反应液液面下，循环反应2～10小时后将反应容器Ⅱ
中的产物旋蒸除去醇，残留物用乙酸乙酯萃取，再将乙酸乙酯进行水洗，萃取液用无水硫酸钠干燥，得苹果酸酯；
或将苹果酸水溶液、醇和浓硫酸在反应容器Ⅰ中混合，然后在搅拌、温度为80～120℃条件下酯化反应，反应过程中形成含苹果酸酯、醇和水的蒸汽混合物，再将蒸汽混合物冷却后通入含醇的反应容器Ⅱ的醇液面下，接着在搅拌、温度为50～90℃条件下蒸馏，蒸馏产生的醇蒸汽回流入反应容器Ⅰ的反应液液面下，循环反应2～10小时后将反应容器Ⅱ中的产物旋蒸除去醇，残留物用乙酸乙酯萃取，再将乙酸乙酯进行水洗，萃取液用无水硫酸钠干燥，得苹果酸酯。
2.根据权利要求1所述苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯的方法，其特征在于：所述苹果酸水溶液与甲醇和无机酸的比例为2～10：5～50：0.5～20(g：mL：mL)。
3.根据权利要求1所述苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯的方法，其特征在于：所述苹果酸水溶液中苹果酸的质量分数为30～80％。
4.根据权利要求1所述苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯的方法，其特征在于：所述浓硫酸为质量分数不低于70％的硫酸溶液。
5.根据权利要求1所述苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯的方法，其特征在于：所述醇为甲醇、乙醇、正丙醇、丙二醇等。
6.根据权利要求1所述苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯的方法，其特征在于：所述苹果酸水溶液由出芽短梗霉发酵生产含聚苹果酸盐的发酵液，然后将发酵液经酸水解制备而得。
7.根据权利要求6所述苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯的方法，其特征在于：所述酸水解的方法如下：将发酵液去除菌体，得发酵清夜，然后将发酵清液浓缩后加入硫酸或盐酸至终浓度为0.5～2M，再在70～95℃条件下酸水解4～10小时，获得苹果酸水溶液。
8.根据权利要求7所述苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯的方法，其特征在于：所述去除菌体的方法是将发酵液用分子量10KDa的超滤膜过滤；所述浓缩是将发酵清液用分子量200Da的纳滤膜浓缩。
9.根据权利要求6所述苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯的方法，其特征在于：所述聚苹果酸盐的制备方法如下：将活化的种子液接种于含发酵培养基的发酵罐中，控制残糖浓度在20g/L以上，在温度为23～30℃、通气比为1:0.8～1:1.6(v/v)发酵96～200小时，发酵过程中流加CaCO 3控制pH为5.0～6.5，当残糖浓度低于20g/L时补加葡萄糖；所述发酵培养基配方为碳源50～200g/L，氮源1～5g，KH 2PO 4 0.005～0.3g/L、ZnSO 4 0.005～0.3g/L和MgSO 4 0.005～0.3g/L；所述碳源为葡萄糖、蔗糖、木糖、糖蜜、乳糖和果糖中的一种或几种；所述氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸钾或硝酸铵中的一种或几种。
权 利 要 求 书1/1页CN 106045856 A
苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物化工领域，具体涉及苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯的方法。
背景技术
[0002]苹果酸酯化物包括苹果酸二甲酯、苹果酸二乙酯、苹果酸二丁酯等化合物，均有重要的使用用途。如苹果酸二甲酯(Dimethyl malate，CAS NO：617-55-0)是一种重要的食品、化工原料及医药中间体，分子量162.14，沸点104-108℃，可用于食品酸味剂、防腐剂，以及化工领域的阻凝剂、荧光增白剂等，具有广泛的市场前景。
[0003]工业上制备苹果酸酯化物是以浓硫酸作为催化剂，用无水苹果酸与醇为原料进行酯化反应制得，此方法存在设备腐蚀严重，副反应多，催化剂必须经过中和才能除去，污染环境及催化剂不能重复使用等问题。此外，由于苹果酸溶解度高，制备苹果酸成品需要在80％(m/v)的过饱和溶液中结晶析出，造成提取浓缩成本居高不下。
[0004]现有的有关苹果酸酯化的文献报道中，多数是以化石来源的D,L-苹果酸成品与不同的酯化剂在各种催化剂下反应生成苹果酸酯，但是将发酵液中的苹果酸直接酯化生产苹果酸酯化物的方法缺乏报道。已有专利报道中，如任晓乾等利用发酵法生产的丁二酸溶液，添加醇、催化剂和萃取剂直接酯化生产丁
二酸二酯(发明专利申请号201410100605.8)，但该方法设计的固载磺酸性杂多酸离子液体为催化剂，催化成本高，同时通过加入多氯代烷烃萃取酯化物，尽管有利于促进反应正向进行，但却进一步增加了萃取分离成本。[0005]因此，为解决下游浓缩、萃取等生产成本问题，亟待开发一种苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯技术。
发明内容
[0006]有鉴于此，本发明的目的在于提供苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯的方法，该方法操作简单，条件可控，下游纯化过程中无需和催化剂，萃取简单，能大幅降低生产成本，同时能大大提高苹果酸酯的收率。
[0007]为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0008]苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯的方法，具体步骤如下：将苹果酸水溶液、醇和无机酸在反应容器Ⅰ中混合，然后在搅拌、温度为80～120℃条件下酯化反应，反应过程中形成含苹果酸酯、醇和水的蒸汽混合物，再将蒸汽混合物冷却后通入反应容器Ⅱ底部，接着在搅拌、温度为50～90℃条件下蒸馏，蒸馏产生的醇蒸汽回流入反应容器Ⅰ的反应液液面下，循环反应2～10小时后将反应容器Ⅱ中的产物旋蒸除去醇，残留物用乙酸乙酯萃取，再将乙酸乙酯进行水洗，萃取液用无水硫酸钠干燥，得苹果酸酯；
[0009]或采用下述技术方案：将苹果酸水溶液、醇和无机酸在反应容器Ⅰ中混合，然后在搅拌、温度为80～120℃条件下酯化反应，反应过程中形成含苹果酸酯、醇和水的蒸汽混合物，再将蒸汽混合物冷却后通入含醇的反应容器Ⅱ的醇液面下，接着在搅拌、温度为50～90
℃条件下蒸馏，蒸馏产生的醇蒸汽回流入反应容器Ⅰ的反应液液面以下，循环反应2～10小时后将反应容器Ⅱ中的产物旋蒸除去醇，残留物用乙酸乙酯萃取，再将乙酸乙酯进行水洗，萃取液用无水硫酸钠干燥，得苹果酸酯。
[0010]本发明中，为了提高苹果酸酯的得率，所述苹果酸水溶液与甲醇和无机酸的比例控制为为2～10：5～50：0.5～20(g：mL：mL)。
[0011]本发明中，理论上含有苹果酸水溶液均可实现，优选的所述苹果酸水溶液中苹果酸的质量分数为30～80％。
[0012]本发明中，所述浓硫酸为质量分数不低于70％的硫酸溶液；所述醇优选为甲醇、乙醇、正丙醇、丙二醇等。
[0013]本发明中，苹果酸水溶液采用微生物直接发酵生产苹果酸，但是用微生物直接发酵法生产苹果酸存在较多的杂酸副产物如丁二酸、乙酸等，酯化将反应生成其他副产物酯，需要采用进一步精馏分离，
其生产成本较高。为克服此问题，优选苹果酸水溶液由出芽短梗霉发酵生产含聚苹果酸盐的发酵液，然后将发酵液经酸水解制备而得。出芽短梗霉发酵法生产的聚苹果酸盐，具有发酵过程不产生杂酸副产物的优势，然后将含聚苹果酸盐的发酵液经酸水解制备得到高纯度L-苹果酸(申请号201210200500.0)水溶液，制得的L-苹果酸水溶液用循环蒸馏法进行酯化制备苹果酸酯。
[0014]本发明中，所述酸水解的方法如下：将发酵液去除菌体，得发酵清夜，然后将发酵清液浓缩后加入硫酸或盐酸至终浓度为0.5～2M，再在70～95℃条件下酸水解4～10小时，获得苹果酸水溶液。所述去除菌体的方法是将发酵液用分子量10KDa的超滤膜过滤；所述浓缩是将发酵清液用分子量200Da的纳滤膜浓缩。
[0015]本发明中，所述聚苹果酸盐的制备方法如下：将活化的种子液接种于含发酵培养基的发酵罐中，控制残糖浓度在20g/L以上，在温度为23～30℃、通气比为1:0.8～1:1.6(v/ v)发酵96～200小时，发酵过程中流加CaCO3控制pH为5.0～6.5，当残糖浓度低于20g/L时补加葡萄糖；所述发酵培养基配方为碳源50～200g/L，氮源1～5g，KH2PO4 0.005～0.3g/L、ZnSO4 0.005～0.3g/L和MgSO4 0.005～0.3g/L；所述碳源为葡萄糖、蔗糖、木糖、糖蜜、乳糖和果糖中的一种或几种；所述氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸钾或硝酸铵中的一种或几种。[0016]本发明中使用的产聚苹果酸菌种以出芽短梗霉Aureobasidium pullulans CCTCC NO：M2012223为例，也可以使用来源于美国农业部菌种保藏中心(NRRL)，美国典型培养物保藏中心(ATCC)，中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)等机构保藏或自然分离产聚苹
果酸的Aureobasidium属或Physarum菌种，这些菌种经发酵均能产生聚苹果酸或聚苹果酸盐，经酸水解后能够获得苹果酸水溶液。
[0017]本发明的有益效果在于：本发明公开的苹果酸水溶液直接酯化生产苹果酸酯的方法，通过采用循环蒸馏进行酯化反应，酯化过程只需添加浓硫酸作为催化剂，而无需添加固体催化剂和萃取剂，并且生成的产物中不含催化剂硫酸，无需中和催化剂，简化了纯化步骤；同时将发酵生产的聚苹果酸盐经酸水解后直接进行酯化，省略了苹果酸水溶液经蒸发浓缩、结晶等步骤，降低了生产成本，并且该方法在降低生产成本的同时还提高了苹果酸酯的收率，与未采用循环蒸馏的方法相比苹果酸酯收率提高了20％以上，对苹果酸酯化合成苹果酸酯具有重要意义，同时本发明可用于发酵法生产丁二酸、富马酸、己二酸等有机羧酸的酯化物合成。
具体实施方式
[0018]下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0019]实施例1
[0020]本实施例是以出芽短梗霉发酵法生产的聚苹果酸或/聚苹果酸盐经酸水解制备得到高纯度L-苹果酸，
然后再将水解后的L-苹果酸直接酯化为苹果酸酯，具体步骤如下：[0021](1)种子活化：将出芽短梗霉FMT1801CCTCC NO：M 2012223单菌落接种于含30mL种子培养基的500ml摇瓶中，在温度为25℃、转速为250rpm条件下震荡培养48小时，得活化种子液；其中种子培养基配方为葡萄糖60g/L、硝酸铵2g/L、KH2PO4 0.05g/L、ZnSO4 0.05g/L，MgSO4 0.05g/L、玉米浆0.05g/L和CaCO3 20g/L；
[0022](2)聚苹果酸发酵：将步骤(1)所得活化种子液接种于含220L发酵培养基的300L发酵罐中，控制残糖浓度在20g/L以上，在温度为25℃、通气比为1:1(v/v)条件下发酵164小时，发酵过程中流加CaCO3控制pH为6.0，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:15；其中发酵培养基配方为葡萄糖120g/L、硫酸铵1g/L、KH2PO4 0.005g/L、ZnSO4 0.005g/ L、MgSO4 0.005g/L、玉米浆0.005g/L和CaCO3 10g/L；所得发酵液中聚苹果酸产量为156g/L；[0023](3)酸水解制备L-苹果酸：将步骤(2)所得发酵液用超滤膜(分子量10KDa)过滤，收集滤液，得到含聚苹果酸盐的发酵清液，然后将发酵清液用纳滤膜(分子量200Da)浓缩，浓缩液中加入硫酸至硫酸终浓度为1M，然后在85℃条件下酸水解5小时，获得质量分数为60％的L-苹果酸水溶液；
[0024](4)苹果酸水溶液酯化：在圆底烧瓶Ⅰ中加入2g步骤(3)所得质量体积分数为60％苹果酸水溶液，20mL甲醇和4mL浓硫酸催化剂，然后搅拌、加热至温度为90℃条件下进行酯化反应，形成含苹果酸酯、甲醇和水的蒸汽混合物，然后将蒸汽混合物经冷凝后通入含20mL 甲醇的圆底烧瓶Ⅱ的液面下，然后在搅拌、加热至温度为70℃，加热产生的甲醇蒸汽回流入圆底烧瓶Ⅰ的反应液液面下，循环反应5小时后
将圆底烧瓶Ⅱ中的反应液旋蒸除去甲醇，剩余液体用50mL乙酸乙酯萃取，再将乙酸乙酯进行水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得苹果酸二甲酯产物，以苹果酸计苹果酸二甲酯产物收率为87％。
[0025]实施例2
[0026]本实施例是以出芽短梗霉发酵法生产的聚苹果酸经酸水解制备得到高纯度L-苹果酸，然后再将水解后的L-苹果酸直接酯化为苹果酸酯，具体步骤如下：
[0027](1)种子活化：将出芽短梗霉FMT1801CCTCC NO：M 2012223单菌落接种于含120mL 种子培养基的500mL摇瓶中，在温度为23℃、转速为180rpm条件下震荡培养96小时，得活化种子液；其中种子培养基配方为葡萄糖40g/L、硝酸铵1g/L、KH2PO4 0.005g/L、ZnSO4 0.005g/L，MgSO4 0.005g/L、玉米浆0.05g/L和CaCO3 10g/L；
[0028](2)聚苹果酸发酵：将步骤(1)所得活化种子液接种于含200L发酵培养基的300L发酵罐中，控制残糖浓度在20g/L以上，在温度为23℃、通气比为1:0.8(v/v)发酵200小时，发酵过程中流加CaCO3控制pH为5.0，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:15；其中发酵培养基配方为蔗糖180g/L、氯化铵3g/L、KH2PO4 0.2g/L、ZnSO4 0.15g/L和MgSO4 0.2g/L；所得发酵液中聚苹果酸产量为156g/L；
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