(19)国家知识产权局
(12)发明专利
(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 202110952076.4
(22)申请日 2021.08.18
(65)同一申请的已公布的文献号
申请公布号 CN 113845576 A
(43)申请公布日 2021.12.28
(73)专利权人 苏州米迪生物技术有限公司
地址 215000 江苏省苏州市工业园区若水
路388号纳米大学科技园D幢506室
(72)发明人 孔迪 方鹏飞 滕小锘 曹文龙
张大鹤
(74)专利代理机构 南京利丰知识产权代理事务
所(特殊普通合伙) 32256
专利代理师 王锋
(51)Int.Cl.
C07K 14/03(2006.01)
C12N 15/38(2006.01)
C07K 19/00(2006.01)
C12N 15/62(2006.01)C12N 15/85(2006.01)C12N 5/10(2006.01)G01N 33/569(2006.01)A61K 39/245(2006.01)A61P 31/22(2006.01)(56)对比文件CN 112457414 A ,2021.03.09CN 111808176 A ,2020.10.23US 2020325182 A1,2020.10.15Ken Maeda 等.Heparin-binding activity of feline herpesvirus type 1 glycoproteins.《Virus Research》.1997，第169-176页.张继一 等.猫疱疹病毒1型部分糖蛋白的研究进展.《养殖技术顾问》.2013，第212-213页.审查员 周振威 (54)发明名称 (57)摘要
本发明公开了一种重组猫疱疹病毒1型gB ‑
gD蛋白及其应用。所述重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD
蛋白包括：具有SEQ ID NO：2所示序列的第一蛋
白；和/或，具有SEQ ID NO：6所示序列的第二蛋
白。所述疫苗包含所述重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD
蛋白以及医药学上可接受的载剂。本发明提供的
重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD蛋白的半衰期长，分子
稳定性高，能形成二聚体特别是异二聚体，免疫
原性强，同时其能通过哺乳动物细胞表达系统以
生物反应器大规模无血清悬浮培养方式制备，不
仅表达水平高，蛋白免疫原性好，而且由此制备
的疫苗还具有质控容易、批次间稳定、生产成本
低等优点。权利要求书1页 说明书13页序列表8页 附图4页CN 113845576 B 2022.05.31
C N 113845576
B
1.一种重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD蛋白，其特征在于，包括：序列如SEQ ID NO:2所示的第一蛋白，以及，序列如SEQ ID NO:6所示的第二蛋白。
2.用于编码权利要求1所述重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，包括：序列如SEQ ID NO:1所示的第一基因，以及，序列如SEQ ID NO:5所示的第二基因。
4.包含权利要求2或3所述基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体选自pSV2‑GS、pCI ‑GS或pcDNA4‑GS。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pCI ‑GS。
7.包含权利要求2或3所述基因的宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自DG44、DXB11、CHO ‑K1或CHO ‑S细胞株。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，
所述宿主细胞为CHO ‑S细胞。10.一种免疫组合物，其特征在于，包括：权利要求1所述重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。
11.如权利要求10所述的免疫组合物，其特征在于，所述医药学上可接受的载剂选自MONTANIDE ISA 206、MONTANIDE ISA 201、MONTANIDE GEL 01 ST、氢氧化铝胶佐剂、明矾、弗氏佐剂、脂多糖、胆固醇、植物油、细胞因子之中的任意一种或者两种以上的组合。
12.如权利要求11所述的免疫组合物，其特征在于，所述医药学上可接受的载剂为氢氧化铝胶佐剂。
13.一种重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD蛋白的制备方法，其特征在于，包括：在合适条件下培养权利要求7‑9中任一项所述的宿主细胞，之后从培养液和/或所述宿主细胞中分离获得权利要求1所述重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD蛋白。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，具体包括：将所述重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD蛋白的编码基因克隆到真核表达载体中，之后转化哺乳动物细胞，再筛选出其中能悬浮稳定高效共表达所述重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD蛋白的细胞株并进行发酵培养，然后分离、纯化获得所述重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD蛋白。
15.如权利要求1所述重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD蛋白或权利要求10‑12中任一项所述免疫组合物在制备猫疱疹病毒1型检测试剂中的用途。
16.如权利要求1所述重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD蛋白或权利要求10‑12中任一项所述免疫组合物在生产用于在受试动物中诱导针对猫疱疹病毒1型抗原的免疫反应的药剂中的用途。
17.如权利要求1所述重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD蛋白或权利要求10‑12中任一项所述免疫组合物在生产用于预防动物受猫疱疹病毒1型感染的药剂中的用途。
18.如权利要求1所述重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD蛋白或权利要求10‑12中任一项所述免疫组合物在制备猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗中的用途。
19.试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述重组猫疱疹病毒1型gB ‑gD蛋白、权利要求2‑3中任一项所述基因、权利要求4‑6中任一项所述重组载体、权利要求7‑9中任一项所述宿主细胞或权利要求10‑12中任一项所述免疫组合物。
权 利 要 求 书1/1页CN 113845576 B
重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白及其应用，例如在制备猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗中的应用，属于动物免疫药物技术领域。
背景技术
[0002]猫疱疹病毒1型(Feline Herpesvirus type 1，FHV‑1)是猫传染性鼻气管炎(Feline Infectious Rchinotracheitis，FIR)的致病原，是造成猫科动物急性上呼吸系统疾病的主要病原之一。FHV‑1只感染猫科动物，其中幼猫最易感染，发病率可达到100％。FHV‑1感染后主要侵害猫的上呼吸道和眼部，病猫会出现体温升高、精神沉郁、咳嗽、打喷嚏等上呼吸道症状以及眼脓性分泌物、角膜结膜炎等眼部症状，严重感染可造成小叶性肺炎，眼周皮肤溃疡。此外，患病猫康复后FHV‑1仍可潜伏于三叉神经、视神经、扁桃体等部位造成终身带毒，在猫免疫力低下或发生应激反应时引起二次感染，引起慢性鼻窦炎、鼻甲骨变性、树枝状角膜炎等临床症状。目前，FHV‑1在世界范围内均有流行，越来越多的野生猫科动物如猎豹、老虎等被发现感染FHV‑1。由此可见FHV‑1对猫科动物的生命和健康造成了严重的威胁。
[0003]FHV‑1属于疱疹病毒目疱疹病毒科α疱疹病毒亚科成员，是有囊膜的线状双股DNA 病毒，其基因组含78个开放阅读框(ORF)，编码74种蛋白质，其中含有23种病毒粒子相关蛋白，13种囊膜蛋白。目前已实验证实的糖蛋白有gB、gC、gD、gG、gE、gH、gI和gL，它们在病毒的识别、侵入、感染、释放
中发挥重要作用(Fa rg ea ud D，Jea nnin C B，Ka to F，e t al.Biochemical Study of the Feline Herpesvirus 1 Identification of Glycoproteins by Affinity[J].Arch Virol，1984，80(2‑3)：69‑82.)。其中gB蛋白具有高度保守性，是一种非常重要的中和抗原，可影响FHV‑1感染侵入途径，与肝素样受体和病毒粒子的结合、以及细胞膜融合过程有关。gD蛋白是病毒囊膜的主要成分，具有高度的抗原性和保守性，能与细胞表面的特定分子发生特异性结合，在病毒复制和刺激机体产生中和抗体的过程中起重要作用，是宿主细胞免疫和体液免疫反应的主要靶细胞之一。
[0004]目前，疫苗免疫是防控FHV‑1最主要的手段之一，主要有灭活疫苗和弱毒疫苗两种。减毒活疫苗是最常使用的疫苗，但它们有残留的毒性，如果接种不当可能会引起临床症状。现有的FHV‑1疫苗能在未感染过病毒的猫身上产生合理的防病保护，但不能预防带毒病猫的感染或疾病的发展。
发明内容
[0005]本发明的主要目的在于提供一种重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白及其应用，以克服现有技术中的不足。
[0006]为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
[0007]本发明实施例提供了一种重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白，其包括：
[0008]第一蛋白，其具有SEQ ID NO：2所示序列或其增加或截短的序列，特别是与SEQ ID
NO：2的全长序列95％以上相同的序列；
[0009]和/或，第二蛋白，其具有SEQ ID NO：6所示序列或其增加或截短的序列，特别是与SEQ ID NO：2的全长序列95％以上相同的序列。
[0010]本发明实施例还提供了用于编码所述重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白的基因。[0011]在一些实施方式中，所述基因包括：
[0012]第一基因，其具有SEQ ID NO：1所示序列或其增加或截短的序列，特别是与SEQ ID NO：1的全长序列95％以上相同的序列；
[0013]和/或，第二基因，其具有SEQ ID NO：5所示序列或其增加或截短的序列，特别是与SEQ ID NO：5的全长序列95％以上相同的序列。
[0014]本发明实施例还提供了一种异二聚体蛋白，其由第一蛋白和第二蛋白组成；所述第一蛋白具有SEQ ID NO：2所示序列或其增加或截短的序列；所述第二蛋白具有SEQ ID NO：6所示序列或其增加或截短的序列。
[0015]如前所述，gB蛋白是FHV‑1中的一种非常重要的中和抗原，其可影响FHV‑1感染侵入途径。gD蛋白在FHV‑1病毒复制和刺激机体产生中和抗体的过程中起重要作用。本发明实施例通过选取了gB蛋白C端区域而非全长蛋白，并在选取的gB蛋白片段和gD蛋白上均添加Fc片段的方式对gB蛋白片段和gD蛋白进行改造，能够延长蛋白的半衰期，提高分子的稳定性，形成稳定的二聚体，增加蛋白的免疫原性。
[0016]优选的，本发明实施例还将改造后gB蛋白片段的氨基酸序列233位D突变成C，以及将改造后gD蛋白的氨基酸序列250位D突变成C，还可以克服位阻效应的影响，使之可以形成异二聚体，从而进一步提升了蛋白结构的稳定性，大幅增强了其免疫原性，这是非常令人惊喜的。
[0017]本发明实施例还提供了包含所述重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白的编码基因的重组载体。
[0018]在一些实施方式中，所述重组载体包括但不限于pSV2‑GS、pCI‑GS或pcDNA4‑GS等，并优选采用pCI‑GS。
[0019]本发明实施例还提供了包含所述重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白的编码基因的宿主细胞。
[0020]在一些实施方式中，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞，包括但不限于DG44、DXB11、CHO‑K1或CHO‑S细胞株等，优选为CHO‑S细胞。
[0021]本发明实施例还提供了一种免疫组合物，其特征在于包括：所述的重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白
或所述的异二聚体蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。
[0022]在一些实施方式中，所述医药学上可接受的载剂包括但不限于MONTANIDE ISA 206、MONTANIDE ISA 201、MONTANIDE GEL 01 ST、氢氧化铝胶佐剂、明矾、弗氏佐剂、脂多糖、胆固醇、植物油、细胞因子之中的任意一种或者两种以上的组合之中的一种或者两种以上的组合，并优选使用氢氧化铝胶佐剂。
[0023]本发明实施例还提供了所述重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白的一种制备方法，其包括：在合适条件下培养所述的宿主细胞，之后从培养液和/或所述宿主细胞中分离获得所述的重组蛋白。
[0024]在一些实施方式中，所述的制备方法具体包括：
[0025]将所述重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白的编码基因克隆到真核表达载体中，之后转化哺乳动物细胞(如CHO细胞)，再筛选出能悬浮稳定高效共表达所述重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白的细胞株并进行发酵培养，然后分离、纯化获得所述重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白。
[0026]其中，用于分离、纯化所述重组蛋白的方法包括但不限于层析、透析或本领域已知的其它方法。
[0027]在一些实施方式中，所述真核表达载体包括但不限于pSV2‑GS、pCI‑GS、pcDNA4‑GS，等，优选采用pCI‑GS。
[0028]在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞可以选自CHO细胞系，例如DG44、DXB11、CHO‑K1、CHO‑S细胞株等且不限于此，优选为CHO‑S。
[0029]本发明实施例还提供了一种猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗的制备方法，其包括：采用前述的任一种方法制备重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白，并将所述重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白与医药学上可接受的载剂混合。
[0030]本发明实施例将设计好的优化后gB蛋白编码基因和优化后gD蛋白编码基因克隆到同一个真核表达载体上，并采用哺乳动物细胞表达系统进行表达，可以提供糖基化修饰，且可将重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白分泌至培养基，进行前述重组蛋白的表达，其不仅表达水平较高，而且所表达的蛋白免疫原性好。
[0031]本发明实施例还提供了所述重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白、所述异二聚体蛋白或所述免疫组合物在制备猫疱疹病毒1型检测试剂，在生产用于在受试动物中诱导针对猫疱疹病毒1型抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受猫疱疹病毒1型感染的药剂中的用途。
[0032]本发明实施例还提供了所述重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白、所述异二聚体蛋白或所述免疫组合物在制备猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗中的用途。
[0033]本发明实施例还提供了一种猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0034](1)制备用于编码所述重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白的核酸分子，即优化后的gB 蛋白编码基因(前述的第一基因)和优化后的gD蛋白编码基因(前述的第二基因)；[0035](2)将步骤(1)中优化后gB蛋白编码基因和优化后gD蛋白编码基因克隆到真核表达载体中，得到含有目的基因的重组载体；
[0036](3)将步骤(2)获得的重组载体转化CHO细胞，通过加压筛选、单克隆筛选得到悬浮稳定高效共表达重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白的CHO细胞株；
[0037](4)发酵培养步骤(3)筛选出的CHO细胞株，纯化后得到重组猫疱疹病毒1型gB‑gD 蛋白；
[0038](5)将所获重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白与佐剂与佐剂充分混匀，得到所述疫苗。[0039]本发明实施例中通过使用CHO细胞株等表达重组猫疱疹病毒1型gB‑gD蛋白，产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对动物(例如猫科动物)没有致病性，并且疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本。
[0040]本发明实施例提供了一种猫疱疹病毒1型重组亚单位疫苗，其包含前述的任一种
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