(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010178025.6
(22)申请日 2020.03.13
(71)申请人 张高华奥生命科学（上海）有限公司
地址 201900 上海市宝山区呼兰路911弄11
号3号楼506
(72)发明人 张启生 赵冰 方敏
(74)专利代理机构 北京植德律师事务所 11780
代理人 唐华东
(51)Int.Cl.
C12N 5/071(2010.01)
C12N 7/00(2006.01)
C12Q 1/70(2006.01)
C12Q 1/02(2006.01)
C12R 1/93(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种类器官病毒感染模型的
构建方法和应用。所述类器官病毒感染模型的构
建方法包括以下步骤：(1)将3D培养的类器官与
病毒感染液混合，然后平面化共孵育，完成感染
过程；(2)感染完成后，使类器官脱离平面化状
态，重新回到3D培养的状态，获得分离培养的3D
类器官。该模型的建立可用于抗病毒药物的高通
量筛选和药物研发，以及用于病毒性疾病致病机
理和对自然发生或实验引起病毒感染的防御机
理的研究，为病毒感染患者的临床提供了新
的策略。
权利要求书6页 说明书13页序列表3页 附图2页CN 111454878 A 2020.07.28
C N 111454878
A
1.类器官病毒感染模型的构建方法，其中，所述构建方法包括以下步骤：
(1)将3D培养的类器官与病毒感染液混合，然后平面化共孵育，完成感染过程；
(2)感染完成后，使类器官脱离平面化状态，重新回到3D培养的状态，获得分离培养的3D类器官；
优选地，所述混合是均匀混合；
优选地，步骤(1)中所述的3D类器官是新鲜获得的3D培养的类器官；
优选地，所述类器官选自人类器官、鼠类器官、狗类器官、猿猴类器官、猩猩类器官，包括肺类器官、肝脏类器官、胆管类器官、消化道类器官、肠道类器官、心脏类器官、肾脏类器官、神经系统类器官、脑类器官、鼻咽类器官或子宫颈类器官；优选地，所述类器官是人类器官；更优选地，所述人类器官选自人肺类器官、人肝脏类器官、人胆管类器官、人消化道类器官、人肠道类器官、人心脏类器官、人肾脏类器官、人神经系统类器官、人脑类器官、人鼻咽类器官和人子宫颈类器官；
优选地，所述病毒选自新型冠状病毒SARS-CoV-2、流感病毒、艾滋病毒、SARS-CoV冠状病毒、MERS-CoV冠状病毒、黄病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅热病毒、结核分支杆菌、埃博拉病毒、肝炎病毒和人HPV病毒；更优选地，所述病毒为新型冠状病毒SARS-CoV-2；更优选地，所述流感病毒为高致病性流感病毒。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其中，步骤(1)中所述病毒感染液是将所述病毒用类器官培养用的培养基稀释后所获得的溶液；
优选地，所述稀释的比例为1:20～1:5；更优选地，稀释的比例为1:10；
优选地，使新型冠状病毒的接种量MOI为10E3-10E7；更优选地，MOI为10E5；
优选地，步骤(1)中，所述的平面化共孵育是指类器官与病毒混合后，在没有基质胶的包裹情况下，2D培养的状态；
优选地，步骤(1)中，所述类器官在Matrigel基质胶或BME基质胶上与病毒平面化共孵育；更优选地，所述类器官在铺有Matrigel基质胶或BME基质胶的平板孔板上与病毒平面化共孵育；
优选地，步骤(2)中，所述使类器官脱离平面化状态，重新回到3D立体培养的状态是在类器官培养用的培养基中进行的；
优选地，步骤(2)中，所述脱离平面化状态是指2D培养的类器官经收集，重新包裹于基质胶中，进行3D培养；优选为将类器官连同病毒液一起收集在离心管中，去除含有病毒的上清液，获取类器官沉淀，并使用PBS冲洗，优选冲洗两遍，去除PBS后，再用Matrigel基质胶重新包裹类器官，进行3D培养。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其中，所述类器官培养用的培养基包括基础培养基Advanced DMEM/F12培养基和其他维持类器官正常生长的生长因子或小分子；
优选地，人肺类器官培养用的培养基包含以下组分：
Advanced DMEM/F12；
B-27；优选地，所述B-27的含量为1％-4％(体积百分比)；更优选地，所述为B-27含量为2％；
FBS；优选地，所述FBS的含量为2％-8％(体积百分比)；更优选地，所述FBS的含量5％；
EGF；优选地，所述EGF是mEGF；优选地，所述EGF浓度为15-40ng/mL；更优选地，所述EGF 浓度为25ng/mL；
Fgf7；优选地，所述Fgf7是hFgf7；优选地，所述Fgf7浓度为80-120ng/mL；更优选地，所述Fgf7浓度为100ng/mL；
Noggin；优选地，所述Noggin是mNoggin；优选地，所述Noggin浓度为80-120ng/mL；更优选地，所述Noggin浓度为100ng/mL；
Jagged-1肽；优选地，所述Jagged-1肽浓度为0.8-1.2μM；更优选地，所述Jagged-1肽浓度为1μM；
SB431542；优选地，所述SB431542浓度为8-12μM；更优选地，所述SB431542浓度为10μM；
CHIR99021；优选地，所述CHIR99021浓度为1-5μM；更优选地，所述CHIR99021浓度为3μM；
Blebbistatin；优选地，所述Blebbistatin浓度为1-5μM；更优选地，所述Blebbistatin 浓度为5μM；
青霉素/链霉素溶液；优选地，青霉素浓度为50-200U/mL，链霉素浓度为50-200μg/mL；更优选地，青霉素/链霉素浓度分别为100U/mL和100μg/mL；
优选地，人肝脏类器官培养用的培养基包括以下组分：
Advanced DMEM/F12；
B-27；优选地，所述B-27的含量为1％-4％(体积百分比)；更优选地，所述为B-27含量为2％；
N-乙酰半胱氨酸；优选地，所述N-乙酰半胱氨酸浓度为0.8-1.2mM；更优选地，所述N-乙酰半胱氨酸浓
度为1mM；
烟酰胺；优选地，所述烟酰胺浓度为8-12mM；更优选地，所述烟酰胺浓度为10mM；
R-Spondin 1；优选地，所述R-Spondin 1浓度为400-600ng/mL；更优选地，所述R-Spondin 1浓度为500ng/mL；
EGF；优选地，所述EGF浓度为160-240ng/mL；更优选地，所述EGF浓度为200ng/mL；
FGF10；优选地，所述FGF10浓度为80-120ng/mL；更优选地，所述FGF10浓度为100ng/mL；
HGF；优选地，所述HGF浓度为15-25ng/mL；更优选地，所述HGF浓度为25ng/mL；
胃泌素；优选地，所述胃泌素浓度为8-12nM；更优选地，所述胃泌素浓度为10nM；
Forskolin；优选地，所述Forskolin浓度为8-12μM；更优选地，所述Forskolin浓度为10μM；
A83-01；优选地，所述A83-01浓度为3-8μM；更优选地，所述A83-01浓度为5μM；
青霉素/链霉素溶液；优选地，青霉素浓度为50-200U/mL，链霉素浓度为50-200μg/mL；更优选地，青霉素/链霉素浓度分别为100U/mL和100μg/mL；
优选地，人肠道类器官培养用的培养基包括以下组分：
Advanced DMEM/F12；
B-27；优选地，所述B-27的含量为1％-4％(体积百分比)；更优选地，所述为B-27含量为2％；
R-Spondin 1；优选地，所述R-Spondin 1浓度为400-600ng/mL；更优选地，所述R-Spondin 1浓度为500ng/mL；
EGF；优选地，所述EGF浓度为160-240ng/mL；更优选地，所述EGF浓度为200ng/mL；
Noggin；优选地，所述Noggin是mNoggin；优选地，所述Noggin浓度为80-120ng/mL；更优选地，所述Noggin浓度为100ng/mL；
青霉素/链霉素溶液：优选地，青霉素浓度为50-200U/mL，链霉素浓度为50-200μg/mL；更优选地，青霉素/链霉素浓度分别为100U/mL和100μg/mL；
更优选地，所述人肺类器官培养用的培养基、人肝脏类器官培养用的培养基或人肠道类器官培养用的培养基包括以下组分：
4.根据权利要求1-3任一项所述的构建方法，其中，所述构建方法还包括：
(3)经过3D培养后，将步骤(2)病毒感染后的获得的分离培养的3D类器官经过破碎细胞，收集病毒，检测病毒；
优选地，所述破碎为机械破碎、裂解液破碎、冻融破碎、表面活性剂破碎和/或超声破碎；更优选地，所述机械破碎为研磨破碎；更优选地，所述破碎为研磨和反复冻融破碎；
优选地，在所述破碎细胞后，还包括沉淀浓缩病毒；更优选地，所述沉淀浓缩病毒采用包含PEG/NaCl沉淀、硫酸铵沉淀或蔗糖梯度差速离心等沉淀浓缩病毒；优选地，所述PEG为PEG-8000；优选地，所述PEG的浓度为8-12％(重量百分比)；更优选地，所述PEG的浓度10％；优选地，所述NaCl的浓度为1.7-2.6％(重量百分比)；更优选地，所述NaCl的浓度2.2％；
更优选地，步骤(3)中，分离培养的3D类器官经过3D培养0～72小时后；优选地，分别在3D培养1h、24h和48h后，将病毒感染后的类器官经过研磨和反复冻融破碎细胞后，离心获得上清液；使所述上清液在含有10％PEG-8000和2.2％NaCl的溶液中沉淀病毒颗粒，并离心获得病毒粗沉淀；优选地，在4℃下10000×g离心30min获取病毒粗沉淀；
优选地，步骤(3)中，所述检测病毒包括检测病毒感染效率，其包括将病毒通过核酸检测方法(Taqman法)，检测新型冠状病毒在细胞内的拷贝数，结合不同时间点的取样，绘制病毒在类器官中的感染复制进程；优选地，通过特异性引物和探针检测核酸；更优选地，所述
特异性探针和引物选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:9所示的寡核苷酸。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其中，所述构建方法还包括：
(4)将步骤(2)获得的分离培养的3D类器官进行抗病毒药物的药敏实验；
优选地，通过CCK-8法检测类器官细胞活性，同时检测病毒拷贝数；更优选地，分别在0h、24h、48h和72h通过CCK-8法检测类器官细胞活性，同时检测病毒拷贝数；
优选地，实验分组设置为：
(i)正常人肺类器官对照组：正常人3D肺类器官培养；
(ii)正常人肺类器官给药组：正常人3D肺类器官与抗病毒药物共同孵育；
(iii)新型冠状病毒感染人肺类器官对照组：新型冠状病毒感染的人肺类器官培养；
(iv)新型冠状病毒感染人肺类器官给药组：新型冠状病毒感染的人肺类器官与抗病毒药物共同孵育；
优选地，抗病毒药物使用量为10μmol；优选地，新型冠状病毒的接种量MOI＝10E5；
优选地，抗病毒药物为磷酸氯喹。
6.通过权利要求1-5任一项类器官感染模型的构建方法获得的3D类器官。
7.权利要求1-5任一项所述的类器官感染模型的构建方法或权利要求6所述的3D类器官在病毒研究中的用途，优选地，所述病毒选自新型冠状病毒SARS-CoV-2、流感病毒、艾滋病毒、SARS-CoV冠状病毒、MERS-CoV冠状病毒、黄病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅热病毒、结核分支杆菌、埃博拉病毒、肝炎病毒和人HPV病毒；更优选地，所述病毒为新型冠状病毒SARS-CoV-2；更优选地，所述流感病毒为高致病性流感病毒。
8.权利要求1-5任一项所述的类器官感染模型的构建方法或权利要求6所述的3D类器官在抗病毒药物的筛选、毒性测定、病毒性疾病致病机理、对自然发生或实验引起病毒感染的防御机理的研究中的用途；优选地，所述筛选是高通量筛选。
9.类器官培养用的培养基，其包括基础培养基Advanced DMEM/F12培养基和其他维持类器官正常生长的生长因子或小分子；
优选地，所述的人肺类器官培养用的培养基包含以下组分：
Advanced DMEM/F12；
B-27；优选地，所述B-27的含量为1％-4％(体积百分比)；更优选地，所述为B-27含量为2％；
FBS；优选地，所述FBS的含量为2％-8％(体积百分比)；更优选地，所述FBS的含量5％；
EGF；优选地，所述EGF是mEGF；优选地，所述EGF浓度为15-40ng/mL；更优选地，所述EGF 浓度为25ng/mL；
Fgf7；优选地，所述Fgf7是hFgf7；优选地，所述Fgf7浓度为80-120ng/mL；更优选地，所述Fgf7浓度为100ng/mL；
Noggin；优选地，所述Noggin是mNoggin；优选地，所述Noggin浓度为80-120ng/mL；更优选地，所述Noggin浓度为100ng/mL；
Jagged-1肽；优选地，所述Jagged-1肽浓度为0.8-1.2μM；更优选地，所述Jagged-1肽浓度为1μM；
SB431542；优选地，所述SB431542浓度为8-12μM；更优选地，所述SB431542浓度为10μM；
CHIR99021；优选地，所述浓度为1-5μM CHIR99021；更优选地，所述CHIR99021浓度为3μ
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