(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710596891.5
(22)申请日 2017.07.20
(71)申请人 中国科学院东北地理与农业生态研
究所
地址 150081 黑龙江省哈尔滨市南岗区哈
平路138号
(72)发明人 卜庆云 田晓杰 李秀峰 王臻昱
(74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事
务所 23109
代理人 侯静
(51)Int.Cl.
C12N 15/29(2006.01)
C07K 14/415(2006.01)
(54)发明名称
编码蛋白
(57)摘要
水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因及其
编码蛋白，它涉及一种水稻BR信号正调控因子
OsWRKY53基因及其编码蛋白。其目的是提供水稻
BR信号正调控因子OsWRKY53基因及其编码蛋白。
水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因的核苷酸
序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。编码水稻BR
信号正调控因子OsWRKY53基因的蛋白的氨基酸
序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。OsWRKY53基
因能够正向调控BR信号及水稻株型，丰富和完善
了水稻BR信号转导通路，对改造水稻株型，进而
提高作物产量提供重要理论依据。本发明应用于
水稻分子育种领域。权利要求书1页 说明书9页序列表9页 附图8页CN 107299102 A 2017.10.27
C N 107299102
A
1.水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
2.编码权利要求1所述的水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因的蛋白，其特征在于该蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
权 利 要 求 书1/1页CN 107299102 A
水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因及其编码蛋白
技术领域
[0001]本发明涉及水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因及其编码蛋白。
背景技术
[0002]水稻是一种重要的粮食作物，世界上一半以上的人口以其为主食，提高水稻作物产量对提高粮食
安全和稳定经济发展具有重要意义。而水稻株型是影响水稻作物产量的一个重要因素，水稻叶夹角又是水稻株型的一个重要组成部分。叶夹角增大，更加利于叶片捕获光，进而提高光合速率，在一定程度上提高作物产量；而叶夹角小，叶片处于直立状态，可以在一定程度上提高种植密度，进而也能够提高作物产量。所以，系统的研究水稻的叶夹角对塑造水稻株型和提高作物产量具有重要的理论和应用价值。在短期内实现林木性状改良的需求，通过转基因手段对其进行遗传改良具有很大意义。 发明内容
[0003]本发明提供一种白桦基因及其编码蛋白和应用。
[0004]本发明水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。
[0005]本发明编码水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
[0006]BR，即油菜素内酯，是一种重要的甾醇类植物激素，参与对植物叶夹角的调控，水稻BR缺陷型突变体如d61-2、d11、BZR1-RNAi、OsGSK2-OE等，叶夹角显著变小；而BR功能获得性突变体如M107、bzr1-D、OsGSK2-RNAi等，叶夹角显著增大，充分表明BR与植物叶夹角调控之间存在着直接的关系。
[0007]本发明公开了水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因及其编码蛋白，本发明利用PCR方法从水稻中克隆出水稻转录因子OsWRKY53基因。本发明获得的OsWRKY53基因编码区全长序列与Rice Genome Annotation Project中公布的LOC_Os05g27730.1相对应。本发明通过遗传转化手段，将OsWRKY53基因在水稻中过量表达，并且发现OsWRKY53基因过表达转基因水稻叶夹角显著增大、种子增大，表现出BR信号增强的表型；通过CRISPR/Cas9敲除技术获得OsWRKY53基因敲除突变体，oswrky53突变体表现出叶夹角变小、种子变小、株高变矮等一系列BR信号缺陷的表型。BR生物合成基因检测、外源BR对叶夹角敏感性分析实验以及OsWRKY53对外源BR处理的响应实验，都充分表明OsWRKY53能够正向调控BR信号。
[0008]本发明首次发现水稻转录因子OsWRKY53基因能够正向调控BR信号及水稻株型。水稻转录因子OsWRKY53作为BR信号正调控因子的发现，在一定程度上丰富和完善了水稻BR信号转导通路，对改造水稻株型，进而提高作物产量提供重要理论依据，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0009]图1为OsWRKY53基因过表达转基因水稻总体形态图；其中WT为野生型水稻，OsWRKY53-OE为OsWRKY53基因过表达转基因水稻；
[0010]图2为OsWRKY53基因过表达转基因水稻叶夹角形态图；其中WT为野生型水稻，OsWRKY53-OE
为OsWRKY53基因过表达转基因水稻；
[0011]图3为OsWRKY53基因过表达转基因水稻叶夹角大小统计结果；其中WT为野生型水稻，OsWRKY53-OE为OsWRKY53基因过表达转基因水稻；
[0012]图4为OsWRKY53基因过表达转基因水稻种子形态图；其中WT为野生型水稻，OsWRKY53-OE-1、OsWRKY53-OE-2、OsWRKY53-OE-3均为OsWRKY53基因过表达转基因水稻；[0013]图5为OsWRKY53基因过表达转基因水稻种子粒长统计结果图；其中WT为野生型水稻，1、2和3均为OsWRKY53基因过表达转基因水稻；
[0014]图6为OsWRKY53基因过表达转基因水稻种子粒宽统计结果图；其中WT为野生型水稻，1、2和3均为OsWRKY53基因过表达转基因水稻；
[0015]图7为3个BR生物合成基因D2、OsDWF4、D11在OsWRKY53基因过表达转基因水稻及野生型的表达量检测结果；其中a为野生型水稻，b、c和d均为OsWRKY53基因过表达转基因水稻；
[0016]图8为oswrky53突变体敲除类型；其中WT为野生型水稻，OsWRKY53-1、OsWRKY53-2均为OsWRKY53基因敲除突变体；
[0017]图9为oswrky53突变体总体形态图；其中WT为野生型水稻，OsWRKY53-1、OsWRKY53-2均为O
sWRKY53基因敲除突变体；
[0018]图10为oswrky53突变体叶夹角形态图；其中WT为野生型水稻，OsWRKY53-1为OsWRKY53基因敲除突变体；
[0019]图11为oswrky53突变体叶夹角大小统计结果；其中a为野生型水稻，b为OsWRKY53基因敲除突变体；
[0020]图12为oswrky53突变体种子形态图；其中WT为野生型水稻，OsWRKY53-1、OsWRKY53-2均为OsWRKY53基因敲除突变体；
[0021]图13为oswrky53突变体种子粒长统计结果；其中WT为野生型水稻，1和2为OsWRKY53基因敲除突变体；
[0022]图14为oswrky53突变体种子粒宽统计结果；其中WT为野生型水稻，1和2为OsWRKY53基因敲除突变体；
[0023]图15为oswrky53突变体株高统计结果；其中WT为野生型水稻，1和2为OsWRKY53基因敲除突变体；
[0024]图16为外源BR对OsWRKY53基因过表达转基因水稻叶夹角的敏感性分析实验的图片；其中WT为野生型水稻，OsWRKY53-OE为OsWRKY53-OE基因过表达转基因水稻；
[0025]图17为外源BR对OsWRKY53基因过表达转基因水稻叶夹角的敏感性分析实验的统计结果；其中a为野生型水稻，b为OsWRKY53-OE基因过表达转基因水稻；
[0026]图18为外源的BR对oswrky53突变体叶夹角敏感性分析实验的图片；其中WT为野生型水稻，OsWRKY53为OsWRKY53基因敲除突变体；
[0027]图19为外源的BR对oswrky53突变体叶夹角的敏感性分析实验的统计结果；其中a 为野生型水稻，b为OsWRKY53基因敲除突变体；
[0028]图20为转录水平上，OsWRKY53基因对BR响应的表达特征分析；其中b为OsWRKY53基因，c为OsDWF4基因；
[0029]图21为蛋白水平上，OsWRKY53对BR响应的表达特征分析。
具体实施方式
[0030]具体实施方式一：本实施方式水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
[0031]本实施方式公开了水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因及其编码蛋白，本实施方式利用PCR方法从水稻中克隆出水稻转录因子OsWRKY53基因。本实施方式获得的OsWRKY53基因编码区全长序列与Rice Genome Annotation Project中公布的LOC_Os05g27730.1相对应。本实施方式通过遗传转化手段，将OsWRKY53基因在水稻中过量表达，并且发现OsWRKY53基因过表达转基因水稻叶夹角显著增大、种子增大，表现出BR信号增强的表型；通过CRISPR/Cas9敲除技术获得OsWRKY53基因敲除突变体，oswrky53突变体表现出叶夹角变小、种子变小、株高变矮等一系列BR信号缺陷的表型。BR生物合成基因检测、外源BR对叶夹角敏感性分析实验以及OsWRKY53对外源BR处理的响应实验，都充分表明OsWRKY53能够正向调控BR信号。
[0032]本实施方式首次发现水稻转录因子OsWRKY53基因能够正向调控BR信号及水稻株型。水稻转录因子OsWRKY53作为BR信号正调控因子的发现，在一定程度上丰富和完善了水稻BR信号转导通路，对改造水稻株型，进而提高作物产量提供重要理论依据，具有广阔的应用前景。
[0033]具体实施方式二：本实施方式编码水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
[0034]通过以下实验验证本发明的效果：
[0035]实施例1、
[0036]1、水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因的克隆及测序：
[0037]一、以野生水稻品种日本晴为实验材料，按照Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册，提取叶片总RNA；
[0038]二、采用DNaseⅠ处理步骤一所提取的总RNA；
[0039]三、取1μg步骤二处理后的总RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照购买自BD Biosciences Clontech公司的BD SMART TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒的使用手册进行，获得cDNA；
[0040]四、以上述获得的c D N A为模板，参照T a K a R a公司的H S DNAPolymerase操作说明书，用正向引物F1与反向引物R1扩增OsWRKY53基因。PCR反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，共38循环；72℃终延伸10min。最后，将PCR产物在ABI3130测序仪(ABI公司)上进行测序，测序结果表明，水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因由1464个碱基组成，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No：1所示。编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。
[0041]正向引物F1：5'-ATGGCGTCCTCGACGGGG-3'
[0042]反向引物R1：5'-CTAGCAGAGGAGCGACTCGACG-3'
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