(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011508479.1
(22)申请日 2020.12.18
(71)申请人 江南大学
地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大
道1800号
(72)发明人 石贵阳 王均华 李由然 朱惠霖
张梁 丁重阳 徐沙 顾正华
(74)专利代理机构 无锡华源专利商标事务所
(普通合伙) 32228
代理人 聂启新
(51)Int.Cl.
C12N 1/19(2006.01)
C12N 15/81(2006.01)
C12P 7/04(2006.01)
C12R 1/865(2006.01)
(54)发明名称
其构建方法与应用
(57)摘要
本发明公布了一种生产香叶基香叶醇的酿
酒酵母工程菌的构建和应用，属于合成生物学技
术领域。本发明筛选获得了在酿酒酵母中转化效
率较高的香叶基香叶基焦磷酸合成酶PaGGPPs。
表达tHMG1、PaGGPPs ‑ERG20和PaGGPPs ‑DPP1可促
进香叶基香叶醇的积累。表达CHK1和IPK1，同时
累。本发明构建的基因工程菌摇瓶发酵最高能够
积累0.77g/L香叶基香叶醇，5L发酵罐120h能够
积累4.
3g/L香叶基香叶醇。权利要求书1页 说明书10页序列表5页 附图4页CN 112501043 A 2021.03.16
C N 112501043
A
1.一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌染体整合表达强化甲羟戊酸途径基因、香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因和两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因，同时缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因； 所述甲羟戊酸途径基因为tHMG1；
所述甲羟戊酸途径基因为双拷贝；
所述香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因为PaGGPPs ‑ERG20和PaGGPPs ‑DPP1；
所述两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因为CHK1和IPK1；
所述整合表达均使用GAL启动子；
所述缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因为缺损ROX1基因。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母YPH499为宿主。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以pMD ‑19T simple为整合表达载体。
4.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述PaGGPPs ‑ERG20的核苷酸序列如SEQ NO:1所示；PaGGPPs ‑DPP1的核苷酸序列为SEQ NO:2。
5.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述tHMG1的核苷酸序列为SEQ NO:3。
6.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述IPK1的核苷酸序列如SEQ NO:4所示；所述CHK1的核苷酸序列为SEQ NO:5；所述ROX1基因核苷酸序列为SEQ NO:6。
7.一种如权利要求1‑6中任一项所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法如下：
通过整合表达强化甲羟戊酸途径基因、香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因和两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因，同时缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因，最终制备得到所述酿酒酵母工程菌。
8.一种如权利要求1‑6中任一项所述的酿酒酵母工程菌在生产香叶基香叶醇的应用。
9.根据权利要求8所述的酿酒酵母工程菌在生产香叶基香叶醇的应用，其特征在于，具体应用方法如下：将所述酿酒酵母工程菌进行活化，接种活化后得到的单菌落置于YPD培养基中进行种子培养，并将所得种子培养液接种至YPD培养基中进行发酵，最终生产得到香叶基香叶醇。
10.根据权利要求8所述的酿酒酵母工程菌在生产香叶基香叶醇的应用，其特征在于，
所述发酵条件为发酵温度为28‑32℃，
转速为200‑220rpm。权 利 要 求 书1/1页CN 112501043 A
一种生产香叶基香叶醇酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
技术领域
[0001]本发明属于合成生物学领域，尤其是涉及一种生产香叶基香叶醇酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
[0002]香叶基香叶醇(geranylgeraniol)，香精油香气成分之一，被用作香水生产的佐料，同时被用作生产疏水性维生素和药剂的原材料。微生物因其生长迅速、合成特异性强、底物成本低等优点成为香叶基香叶醇合成研究重点。酿酒酵母(Sa c c ha r o m y c e s cerevisiae)是最简单的真核模式微生物，成熟快速的基因操作技术和内源性甲羟戊酸途径的存在使酿酒酵母成为了萜类化合物合成研究的热点。为了提高香叶基香叶醇前体香叶基香叶基焦磷酸的供给，有报道香叶基香叶基焦磷酸合酶的效率是二萜化合物合成的一个限速步骤，过表达BTS1‑ERG20和BTS1‑DPP1可以促进香叶基香叶醇的积累。同时，也有报道过表达HMG‑CoA还原酶活性区域编码基因(tHMG1)可以提高异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)的供给。到目前为止，没有报道同时表达外源香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因和两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因对酿酒酵母香叶基香叶醇合成的影响。
发明内容
[0003]本申请针对现有技术的不足，本发明提供了一株生产香叶基香叶醇酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。本发明制备得到酿酒酵母工程菌生产香叶基香叶醇具有较高产率。本发明的技术方案如下：
[0004]一种酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌染体整合表达强化甲羟戊酸途径基因、香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因和两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因，同时缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因；
[0005]所述甲羟戊酸途径基因为tHMG1；
[0006]所述甲羟戊酸途径基因为双拷贝；
[0007]所述香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因为PaGGPPs‑ERG20和PaGGPPs‑DPP1；[0008]所述两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因为CHK1和IPK1；
[0009]所述整合表达均使用GAL启动子；
[0010]所述缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因为缺损ROX1基因。[0011]所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母YPH499为宿主。
[0012]所述酿酒酵母工程菌以pMD‑19T simple为整合表达载体。
[0013]所述PaGGPPs‑ERG20的核苷酸序列如SEQ NO:1所示；PaGGPPs‑DPP1的核苷酸序列为SEQ NO:2。
[0014]所述tHMG1的核苷酸序列为SEQ NO:3。
[0015]所述IPK1的核苷酸序列如SEQ NO:4所示；所述CHK1的核苷酸序列为SEQNO:5；所述ROX1基因核苷酸序列为SEQ NO:6。
[0016]一种酿酒酵母工程菌的构建方法，所述构建方法如下：
[0017]通过整合表达强化甲羟戊酸途径基因、香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因和两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因，同时缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因，最终制备得到所述酿酒酵母工程菌。
[0018]一种所述的酿酒酵母工程菌在生产香叶基香叶醇的应用。
[0019]具体应用方法如下：将所述酿酒酵母工程菌进行活化，接种活化后得到的单菌落置于YPD培养基中进行种子培养，并将所得种子培养液接种至YPD培养基中进行发酵，最终生产得到香叶基香叶醇。
[0020]所述发酵条件为发酵温度为28‑32℃，转速为200‑220rpm。
[0021]本发明有益的技术效果在于：
[0022]本发明比较了不同香叶基香叶基焦磷酸合酶对香叶基香叶醇合成的影响，同时引入异戊烯基焦磷酸两步合成途径和缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因ROX1，构建了一种香叶基香叶醇高效合成菌株，具有工业化应用前景。过表达甲羟戊酸代谢途径限速步骤编码基因tHMG1，是为了增强甲羟戊酸途径的代谢流，提供充足的前体IPP和DMAPP合成FPP和GGPP；引入两步法合成途径，是为了增加前体IPP合成FPP和DMAPP；缺损转录抑制因子编码基因ROX1，是为了提高甲羟戊酸途径基因的转录水平，进一步增强甲羟戊酸合成IPP和DMAPP的能力；表达外源香叶基香叶基焦磷酸合成酶，是为了促进FPP转化成GGPP，提高香叶基香叶醇的产量，同时弱化甾醇途径(竞争途径)消耗FPP。
附图说明
[0023]图1是本发明示意图
[0024]图2是本发明中质粒Ts‑LYS2‑tP示意图。
[0025]图3是本发明中质粒Ts‑TRP1‑tP示意图。
[0026]图4是本发明中质粒Ts‑URA3‑101BD示意图。
[0027]图5是本发明中质粒Ts‑80B20示意图。
[0028]图6是本发明中质粒Ts‑URA3‑101PD示意图。
[0029]图7是本发明中质粒Ts‑80P20示意图。
[0030]图8是本发明中质粒Ts‑LEU2‑IPC示意图。
[0031]图9是本发明中质粒BTS‑ROX1示意图。
[0032]图10是本发明中不同基因操作对工程菌合成香叶基香叶醇的影响比较。[0033]图11是本发明中工程菌G9 5L发酵罐合成香叶基香叶醇情况。
具体实施方式
[0034]下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
[0035]本发明中发酵及种子培养基：YPD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L 葡萄糖)，发酵时加入10％十二烷(V/V)，使用前115℃灭菌20min。
[0036]测定发酵液中香叶基香叶醇浓度的方法：仪器：Thermo Fisher U3000高效液相系统；谱柱：Waters C18柱；流动相：甲醇、乙腈和水混合物(90:5:5)；检测条件：紫外210nm，流速0.8mL/min，柱温40℃。标准品：香叶基香叶醇(SIGAMA)。
[0037]醋酸锂转化的方法：收集4mL菌液，离心收集菌体，用无菌水和0.1M醋酸锂溶液分别洗涤，然后依次加入240μL 50％PEG3350溶液、36μL 1M醋酸锂溶液、50μL鲑鱼精溶液和50μL转化产物，混匀，30℃培养环境静置30min。42℃热激25min，30℃，200rpm后培养1h。[0038]通过从酿酒酵母基因组DNA扩增了相关基因、启动子和终止子构建了过表达的甲羟戊酸途径；经密码子优化和基因合成构建了香叶基香叶醇合成开关。香叶基香叶醇合成工程菌株构建流程见图1。
[0039]下述实施例中所用到的菌株如表1所示
[0040]表1菌株
[0041]
[0042]实施例中所用到的引物如表2所示
[0043]表2引物
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