(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510215155.1
(22)申请日 2015.04.30
C12Q 1/68(2006.01)
(71)申请人余家昌
地址美国加利福利亚州旧金山市路得镇
361号
申请人埃捷思生物科技有限公司
奥健生物科技（广州）有限公司
(72)发明人杜正平 熊槐
(74)专利代理机构东莞市华南专利商标事务所
有限公司 44215
代理人
刘克宽
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及多聚酶链反应（PCR）技术领域，特
别是涉及一种多荧光熔解曲线PCR 检测方法，
该检测方法采用能够与待测靶标基因特异性杂交
荧光检测探针，对待测样品中的多个靶标基因同
时进行检测，通过在DNA 扩增过程中，生成与每一
个待测靶标基因对应的特异条形码序列，再由条
形码序列经过DNA 扩增形成标记了不同荧光基团
和淬灭基团的特异性的不同长度的DNA 产物，并
通过最终的多荧光熔解曲线分析，从而实现基
于熔解曲线分析的PCR 多重检测。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书2页 说明书7页序列表4页 附图2页CN 106191214 A 2016.12.07
C N 106191214
A
1. 一种多荧光熔解曲线PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、根据待测靶标基因的特异性序列合成一对引物；
b、合成条形码探针，条形码探针的3’端为待测靶标基因位于两条引物之间的探针序列，5’端为标记淬灭基团的具有一定长度的条形码序列；
c、合成荧光检测探针，荧光检测探针为一条具有茎环结构的序列，其3’端为与所述条形码序列特异性结合的条形码识别序列，5’端序列与3’端序列互补配对，中间为任意一段与待测靶标基因不相关且与条形码序列不相关的序列，3’端和5’端分别标记发光基团和淬灭基团；
d、PCR扩增：
1）每一轮PCR反应中，经过变性步骤之后，在退火步骤，探针序列与待测靶标基因识别，上游引物和下游引物与待测靶标基因识别；
2）在延伸步骤中，在DNA聚合酶作用下，上游引物和下游引物开始延伸，具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶水解探针序列，使条形码探针的条形码序列被释放；
3）进入下一轮PCR反应中，在变性步骤中，荧光检测探针的茎环结构打开，退火步骤中，上一轮PCR循环中释放的条形码序列与荧光检测探针的条形码识别序列特异性结合；
4）进入延伸步骤，条形码序列以荧光检测探针为模板合成双链DNA产物；
e、多荧光熔解曲线检测分析PCR产物：
在PCR反应结束之后，以荧光检测探针为模板合成的双链DNA产物，随着温度的升高开始解链，发光基团与淬灭基团与DNA链一起发生分离，发光基团发出的不同波长的荧光被荧光PCR仪检测，根据多荧光融解曲线分析PCR产物。
2. 根据权利要求1所述的一种多荧光熔解曲线PCR检测方法，其特征在于：条形码探针3’端的探针序列完全与待测靶标基因互补配对，不完全互补配对的条形码探针不能被具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶水解释放条形码序列。
3. 根据权利要求1所述的一种多荧光熔解曲线PCR检测方法，其特征在于：所述荧光探针体系包括多个条形码探针和多个荧光检测探针，每个荧光检测探针的茎环结构的序列长度不同。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种多荧光熔解曲线PCR检测方法，其特征在于：所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ-2中的任意一种，所述荧光基团为Pacific Blue、Oregon Green、Bodip
y FL-X、FAM、TET、Bodipy R6G-X、JOE、HEX、Cy3、Rhodamine Red-X、TAMRA、Cy3.5、Texas Red-X、ROX中的任意一种。
5. 采用权1至4任意一项所述的多荧光熔解曲线PCR检测方法检测待测基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：
a、条形码探针，其3’端为待测靶标基因位于两条引物之间的探针序列，5’端为标记淬灭基团的具有一定长度的条形码序列；
b、具有茎环结构的荧光检测探针，其3’端为与所述条形码序列特异性结合的条形码识别序列，5’端序列与3’端序列互补配对，中间为任意一段与待测靶标基因不相关且与条形码序列不相关的序列，3’端和5’端分别标记发光基团和淬灭基团；
c、耐热DNA聚合酶；
d、根据待测基因合成的一对引物；
e、dATP、dTTP、dCTP及dGTP；
f、PCR缓冲液。
6. 根据权利要求5所述的采用多荧光熔解曲线PCR检测方法检测待测基因的试剂盒，其特征在于：所述耐热DNA聚合酶为具有5’-3’外切核酸酶活性的耐热DNA聚合酶。
7. 根据权利要求5所述的采用多荧光熔解曲线PCR检测方法的检测待测基因的试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液为含镁离子、Triton X-100、硫酸铵、氯化钾、Tris-HCl 的混合溶液。
一种多荧光熔解曲线PCR检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及多聚酶链反应（PCR），特别是涉及一种多荧光熔解曲线PCR检测方法。
背景技术
[0002] 多聚酶链反应（PCR）是一种利用耐热DNA聚合酶在体外进行基因扩增的技术，在基因克隆/疾病诊断/法医鉴定等多个领域被广泛应用。普通PCR技术需要在扩增之后，对产物进行电泳分析，分析过程繁琐费时。随着TaqMan TM水解探针的发明，以及双链DNA荧光染料的使用，PCR产物可以通过实时荧光的方法进行分析检测，这种新的PCR技术被称为实时荧光定量PCR。与普通PCR技术相比，实时荧光定量PCR具有明显的优势，实时荧光定量PCR技术的DNA扩增与结果检测同时进行，省去了反应后的电泳分析，同时降低了污染的可能性。
[0003] 现有技术中，应用TaqMan TM水解探针的实时荧光定量PCR的原理是：在上游引物的下游增加一条识别靶标序列的TaqMan TM水解探针，探针的5’和3’端分别标记发光基团和淬灭基团，淬灭基团通过荧光共振能量转移（ fluorescence resonance energy transfer，FRET）吸收发光基团的荧光能量，淬灭发光基团的荧光信号，在PCR扩增过程中，DNA聚合酶与上游引物一起从5’端往3’端延伸，延伸至TaqMan TM水解探针处时，DNA聚合酶的5’外切核酸酶发挥作用，从5’端开始水解探针，发光基团和淬灭基团发生分离，发光基团被激发并发射荧光。通过在同一反应体系中，设置多条标记不同波长的荧光基团的TaqMan TM水解探针，可实现多重PCR检测。但是，基于TaqMan TM水解探针的实时荧光定量PCR检测方法的缺陷在于：一种颜的荧光基团只能标记一条TaqMan TM水解探针，检测一个待测基因，因此，其多重检测能力有限。
[0004] 现有技术中，应用双链DNA荧光染料的实时荧光定量PCR的原理是：双链DNA荧光染料在未嵌入DNA之前，不能被激发，一旦嵌入双链DNA中，就可以被激发并发射特定波长的荧光，在染料过量的情况下，检测到的荧光信号的强弱与反应物中双链DNA的量呈正比，因此可以通过仪器记录荧光信号的强弱来实时检测PCR产物中DNA的浓度。在该技术的基础之上，还发展出了熔解曲线分析法（Melting Curve analysis），熔解曲线分析法是利用不同DNA序列具有不同Tm值（DNA的双螺旋结构降解一半时的温度）的特征，在PCR反应之后，通过逐渐提高反应物的温度，使具有不同Tm值的双链DNA依次变性成为单链DNA，但是，由于荧光染料不能与单链DNA结合被激发，因此，在双链DNA特定Tm值对应
的温度下，荧光强度大幅度减弱，熔解曲线分析法利用这一原理可以对PCR产物中不同长度DNA或相同长度不同序列DNA进行分析。
[0005] 随着对多重PCR检测需求的提高，需要新技术对原有的技术进行升级。但是，由于荧光基团本身发射的不是单一波长的荧光，且PCR仪对不同荧光基团发射的荧光区分度有限，因此，现有的PCR仪只能检测4~6种荧光基团发射的荧光信号，这也使得应用TaqMan TM 水解探针法的实时荧光定量PCR的多重检测能力受到限制。而应用双链DNA荧光染料的实
时荧光定量PCR，由于染料不具备特异序列的识别能力，因此，同一反应体系中只能使用一种双链DNA荧光染料。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于避免现有技术中的不足之处而提供一种成本低、多重检测能力更强的多荧光熔解曲线PCR检测方法及采用该方法检测待测基因的试剂盒。
[0007] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
提供一种多荧光熔解曲线PCR检测方法，包括以下步骤：
a、根据待测靶标基因的特异性序列合成一对序列；
b、合成条形码探针，条形码探针的3’端为待测靶标基因位于两条引物之间的探针序列，5’端为标记淬灭基团的具有一定长度的条形码序列；
c、合成荧光检测探针，荧光检测探针为一条具有茎环结构的序列，其3’端为与所述条形码序列特异性结合的条形码识别序列，5’端序列与3’端序列互补配对，中间为任意一段与待测靶标基因不相关且与条形码序列不相关的序列，3’端和5’端分别标记发光基团和淬灭基团；
d、PCR扩增：
1）每一轮PCR反应中，经过92-97℃变性步骤之后，在50-65℃退火步骤，探针序列与待测靶标基因识别，上游引物和下游引物与待测靶标基因识别；
2）在58-75℃延伸步骤中，在DNA聚合酶作用下，上游引物和下游引物开始延伸，具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶水解探针序列，使条形码探针的条形码序列被释放；
3）进入下一轮PCR反应中，在92-97℃变性步骤中，荧光检测探针的茎环结构打开，50-65℃退火步骤中，上一轮PCR循环中释放的条形码序列与荧光检测探针的条形码识别序列特异性结合；
4）进入58-75℃延伸步骤，上一轮PCR循环中的条形码序列以荧光检测探针为模板合成双链DNA产物；
e、多荧光熔解曲线检测分析PCR产物：
在PCR反应结束之后，以荧光检测探针为模板合成的双链DNA产物，随着温度的升高开始解链，发光基团与淬灭基团与DNA链一起发生分离，发光基团发出的不同波长的荧光被PCR仪检测，根据多荧光融解曲线分析PCR产物。
[0008] 熔解曲线分析法是利用不同DNA序列具有不同Tm值的特征，在PCR反应之后，通过逐渐提高反应物的温度，使具有不同Tm值的双链DNA依次变性成为单链DNA，根据这一原理可以对PCR产物中不同长度DNA或相同长度不同序列DNA进行分析。
[0009] 上述技术方案中，条形码探针3’端的探针序列完全与待测靶标基因互补配对，不完全互补配对的条形码探针不能被具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶水解释放条形码序列。
[0010] 上述技术方案中，所述荧光探针体系包括多个条形码探针和多个荧光检测探针，每个荧光检测探针的茎环结构的序列长度不同，从而使得不同的荧光检测探针具有不同的Tm值，在PCR扩增后形成标记了不同荧光基团和淬灭基团的特异性的不同长度的DNA产物，并通过最终的多荧光熔解曲线分析，在多个荧光通道产生不同Tm值DNA产物特异熔解曲
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