(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011457369.7
(22)申请日 2020.12.11
(71)申请人 上海陶宇晟生物技术有限责任公司
地址 201201 上海市浦东新区瑞庆路528号
1号楼甲
(72)发明人 蒋宇
(74)专利代理机构 上海申浩律师事务所 31280
代理人 贾师英
(51)Int.Cl.
C12N 1/21(2006.01)
C12N 15/54(2006.01)
C12N 15/31(2006.01)
C12N 15/55(2006.01)
A61K 35/74(2015.01)
A61P 3/00(2006.01)
C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种具有降解苯丙氨酸能力
的工程益生菌的构建方法，包括以下步骤：以具
Nissle 1917为底盘菌，增强精氨酸合成途径。本
发明构建的工程益生菌能够用于苯丙酮尿
症。权利要求书1页 说明书16页序列表3页 附图2页CN 112501098 A 2021.03.16
C N 112501098
A
1.一种提高大肠杆菌Nissle 1917降解苯丙氨酸能力的方法，包括以下步骤：
A.以具有L ‑苯丙氨酸解氨酶基因表达能力的大肠杆菌Nissle 1917为底盘菌，增强精氨酸合成途径。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增强精氨酸合成途径的步骤为：失活基因argR并且/或者进行argA抗反馈抑制突变。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述argA抗反馈抑制突变为Y19C突变。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
B.使底盘菌表达L ‑苯丙氨酸内运蛋白基因，和/或
C.使底盘菌表达L ‑氨基酸脱氨酶基因。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述L ‑苯丙氨酸解氨酶基因是stlA(SEQ ID NO:1)；所述L ‑苯丙氨酸内运蛋白基因是pheP(SEQ ID NO:2)；所述L ‑氨基酸脱氨酶基因是pma(SEQ ID NO:3)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具有L ‑苯丙氨酸解氨酶基因stlA表达能力的大肠杆菌Nissle 1
917的基因型是：EcN(malP::Pj23119‑stlA)。
7.一种具有降解苯丙氨酸能力的工程益生菌，其特征在于，按照如权利要求1‑6中任一项中所述的方法构建。
8.如权利要求7所述的工程益生菌，其特征在于，菌株的基因型是：EcN (malP::Pj23119‑stlA ,yicS::Pj23119‑stlA ,malE::Pj23119‑stlA ,rthC::Ptac ‑stlA ,exo::Ptac ‑stlA ,lacZ::Pj23119‑pheP,agaI::Pj23119‑pheP,araBD::Para ‑pma ,△dapA)；或者
EcN(malP::Pj23119‑stlA ,yicS::Pj23119‑stlA ,malE::Pj23119‑stlA ,rthC::Ptac ‑stlA ,exo::Ptac ‑stlA ,lacZ::Pj23119‑pheP ,agaI::Pj23119‑pheP ,araBD::Para ‑pma ,△dapA ,argA*,△argR)。
9.如权利要求7或8所述的工程益生菌在制备苯丙酮尿症药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物是口服剂型。
权 利 要 求 书1/1页CN 112501098 A
具有降解苯丙氨酸能力的工程益生菌
技术领域
[0001]本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种具有降解苯丙氨酸能力的工程益生菌及其构建方法具有降解苯丙氨酸能力的工程益生菌。
背景技术
[0002]苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种先天性的苯丙氨酸代谢障碍疾病。在中国，PKU在新生儿中的发病率大概在1/11000，PKU患儿出生若不及时诊治，将会出现高苯丙酸血症。
[0003]苯丙酮尿症是因肝脏苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)缺乏或四氢生物喋呤合成酶、二氢生物喋呤还原酶突变导致。PAH主要是在肝脏中表达，可将苯丙氨酸转化为酪氨酸，从而合成甲状腺、肾上腺和黑素等。PAH突变，导致苯丙氨酸在肝脏中出现代谢紊乱，无法转化为酪氨酸，而是苯丙氨酸与α‑酮戊二酸在血液与组织中堆积并被排泄到尿液中，另外，其代谢产物在中枢神经中蓄积会产生毒性，从而诱发患儿出现兴奋不安、多动和精神异常等。
[0004]苯丙氨酸作为人体必需氨基酸之一，主要从食物中获取，对于PKU患儿不能无苯丙氨酸饮食，所以目前对PKU患儿的唯一方法就是采取低苯丙氨酸饮食。另外，目前也有一些针对PKU的策略尚在实验阶段，例如，通过体外重组表达具有苯丙氨酸降解能力的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia‑lase，stlA)，通过口服蛋白降低血液中苯丙氨酸，但缺点是直接口服蛋白易被肠道内的消化酶分解。科学家也在尝试基因疗法，将携带表达PAH基因的cDNA重组腺病毒置于小鼠体内，以恢复肝脏P
AH活性，但目前主要存在转运效率低的问题。
发明内容
[0005]益生菌是一大类药物，主要通过口服活菌制剂达到疾病和康复保健效果。益生菌药物制剂的优点在于给药方便，口感一般较好，病人乐于接受，顺从性高，更重要的是能够持续地在肠道内增殖从而稳定地发挥作用。
[0006]大肠杆菌属E.coli Nissle 1917(简写为EcN)是一种非致病性大肠杆菌，是1917年从一次志贺菌痢大爆发时未出现腹泻的士兵的粪便中分离得到的。EcN是非乳酸益生菌中研究最多的益生菌，血清型为O6：K5：H1，具有独特的基因组、半粗糙O6‑脂多糖(LPS)表型、K5型荚膜、3种不同的菌毛(F1A、F1C和卷曲菌毛)。EcN具有小菌素和铁摄取系统等特殊适应性因子，在与其他微生物竞争中起关键作用。EcN能长期稳定定植于肠道，与肠上皮细胞相互作用，被广泛用于预防传染性腹泻、炎性肠疾病如溃疡性结肠炎和克罗恩病，防止新生儿消化道内病原菌定殖等，和发挥免疫调节生物学功能。
[0007]为了寻求新的苯丙酮尿症药物，发明人利用基因工程技术来改造大肠杆菌Nissle1917(EcN)，使其对苯丙氨酸具有降解能力，构建出了一株经动物实验证明具有苯丙酮尿症效果的工程益生菌。具体而言，本发明包括如下技术方案：
[0008]一种提高大肠杆菌Nissle 1917降解苯丙氨酸能力的方法，包括以下步骤：[0009] A.以具有L‑苯丙氨酸解氨酶基因表达能力的大肠杆菌Nissle 1917为底盘菌，增强精氨酸合成途径。
[0010]上述增强精氨酸合成途径(或称“精氨酸强化途径”)的步骤可以为：失活基因argR 并且/或者进行argA抗反馈抑制突变。
[0011]在一种实施方式中，上述argA抗反馈抑制突变优选为Y19C突变。
[0012]上述方法还可以包括以下步骤：
[0013] B.使底盘菌表达L‑苯丙氨酸内运蛋白基因。
[0014]进一步地，上述方法还可以包括以下步骤：
[0015] C.使底盘菌表达L‑氨基酸脱氨酶基因。
[0016]在一种优选的实施方式中，上述步骤A、B和C可以通过基因编辑技术实施，所述基因编辑采用CRISPR‑Cas9系统、CRISPR‑Cpf1系统、CRISPR‑Cas相关的转座系统INTEGRATE系统或者CAST系统。
[0017]上述INTEGRATE系统是指Sam Sternberg研究组开发的基因编辑工具(Insertion of transposable elements by guide RNA‑assisted targeting，引导RNA辅助靶向的转座元件插入)；CAST系统是指张锋研究组开发的基因编辑工具(CRISPR‑associated transposase，CRISPR相关转座酶)。
[0018]优选地，上述方法中，所述L‑苯丙氨酸解氨酶(Genbank号KGM29850.1)基因是stlA，核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
[0019]所述L‑苯丙氨酸内运蛋白(Genbank号QPA14453.1)基因是pheP，核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
[0020]所述L‑氨基酸脱氨酶(Genbank号AAA86752.1)基因是pma，核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
[0021]上述方法中，所述具有L‑苯丙氨酸解氨酶基因比如stlA表达能力的大肠杆菌Nissle1917的基因型是：EcN(malP::Pj23119‑stlA)。由于EcN是E.coli Nissle1917的缩写，故其中的EcN也可表示为Nissle 1917，即该菌株基因型也可以表示为Nissle 1917 (malP::Pj23119‑stlA)。
[0022]根据本发明的第二个方面，提供了一种基因工程菌，其为具有降解苯丙氨酸能力的工程益生菌，其按照上述的方法构建。
[0023]优选地，该工程益生菌的基因型是：EcN(malP::Pj23119‑stlA,yicS::Pj23119‑stlA,malE::Pj23119‑stlA,rthC::Ptac‑stlA,exo::Ptac‑stlA,lacZ::Pj23119‑pheP,
agaI::Pj23119‑pheP,araBD::Para‑pma,△dapA)，本文中命名为TYS009；或者
[0024]EcN(malP::Pj23119‑stlA,yicS::Pj23119‑stlA,malE::Pj23119‑stlA,rthC:: Ptac‑stlA,exo::Ptac‑stlA,lacZ::Pj23119‑pheP,agaI::Pj23119‑pheP,araBD::Para‑pma,△dapA,argA*,△argR)，本文中命名为TYS010。其中argA*尤其是指Y19C突变，可表示为argAmut(Y19C)。
[0025]相比工程益生菌TYS009，工程益生菌TYS010进一步强化了精氨酸合成途径。[0026]根据本发明的第三个方面，提供了上述工程益生菌在制备苯丙酮尿症药物中的应用。
[0027]上述药物优选是口服剂型，可通过口服给药。相应地，药物剂型为适用于口服、同时保持益生菌活性的口服剂型，包括固体颗粒、片剂和液体活菌制剂。
[0028]可选地，所述药物中，除了药物活性成分工程益生菌外，还包含至少一种辅助剂，从而形成复方药物。优选地，所述辅助剂是其他用于苯丙酮尿症、但不损害益生菌活性的药物成分。
[0029]通过体外实验表明，本发明的工程益生菌TYS009和TYS010能够降解苯丙氨酸，生成反式肉桂酸；经小鼠口服实验证明，本发明的工程益生菌TYS009和TYS010能够对苯丙酮尿症小鼠血液中苯丙氨酸进行降解，表明菌株TYS009和TYS010具有苯丙酮尿症的效果，具有开发应用前景。
附图说明
[0030]图1为原始菌株E.coli Nissle 1917、工程菌TYS014和TYS015对苯丙氨酸进行降解生成反式肉桂酸的柱形图。
[0031]图2为原始菌株E.coli Nissle 1917、工程菌TYS009和TYS010对苯丙氨酸进行降解生成反式肉桂酸的柱形图。
[0032]图3为原始菌株E.coli Nissle 1917、工程菌TYS009和TYS010降解苯丙酮尿症小鼠血液中苯丙氨酸的统计图。
具体实施方式
[0033]本发明在不具有降解苯丙氨酸能力的原始大肠杆菌Nissle 1917的基础上，通过基因组改造，使其能够表达苯丙氨酸解氨酶基因，从而具备了降解苯丙氨酸能力；然后通过失活基因argR并且对argA做抗反馈抑制突变(Y19C)，增强了精氨酸合成途径；接着，进一步通过基因工程使菌株能够表达L‑苯丙氨酸内运蛋白基因和/或L‑氨基酸脱氨酶基因，得到了对苯丙氨酸降解能力显著提高的工程益生菌TYS009和TYS010。
[0034]为简要起见，本文中有时将“工程益生菌”简称为“(基因)工程菌”或者“益生菌”，它们表示相同的意义，可以互换使用。
[0035]基因argR是一个在细菌中普遍存在的精氨酸操纵子调节基因，在不同的细菌中有不同的功能，发明人研究发现，通过敲除大肠杆菌Nissle 1917基因组中的这一负调控基因，可一定程度上解除其对精氨酸合成的抑制。
[0036]N‑乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)编码基因argA，Y19C突变具有解除精氨酸反馈抑制的效果。
[0037]在一种具体实施方式中，本发明是在益生菌E.coli Nissle 1917基因组上引入了利用组成型启动子Pj23119调控来源于发光分枝杆菌(Photorhabdus luminescens)的苯丙氨酸解氨酶(stlA)和增强了大肠杆菌MG1655来源苯丙氨酸特异转运体(pheP)，可有效提高胞内苯丙氨酸的运输，并将转化为反式肉桂酸；同时引入了来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis HI4320)的L‑氨基酸脱氨酶(pma)，可将苯丙氨酸降解为苯丙酮酸；敲除argR和突变argA(Y19C)强化精氨酸合成途径，可有效利用苯丙氨酸被转化为反式肉桂酸和苯丙酮酸时释放的氨，从而促进苯丙氨酸向反式肉桂酸和苯丙氨酸转化反应进行，达到有效降解苯丙氨酸目的。
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