[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1706494A
[43]公开日2005年12月14日
[21]申请号200510033959.6[22]申请日2005.04.07
[21]申请号200510033959.6
[71]申请人深圳大学
地址518060广东省深圳市南山区南油大道2336
号
共同申请人广州医学院
[72]发明人刘志刚 冉丕鑫 邢苗 钟南山 吉坤美
高波 喻海琼 夏立新 白羽 [51]Int.CI 7A61K 39/00A61P 37/08A61P 11/06
权利要求书 1 页 说明书 10 页
[54]发明名称
法
[57]摘要
本发明涉及一种以纳米粒子为载体制备尘螨变
应原疫苗的方法。尘螨是引起过敏性疾病的主要变
应原之一。本发明应用生物可降解的PLGA纳米粒子
作为变应原载体，包裹尘螨重组变应原Der p2/Der
f2，制成纳米级尘螨变应原疫苗。具体地说采用
基因工程技术在大肠杆菌中克隆和表达制备重组De
r p2/Der f2蛋白，并采用复乳－溶媒挥发法制备P
LGA包裹的纳米粒子。根据溶液外观评分及扫描电
镜观测法判断粒子形态，用颗粒分析仪测定纳米粒
子的平均粒径。采用BCA法测定纳米粒子的包封率、
载药量并绘制纳米粒子体外累积释放曲线。并通过
实验证实Der p2/Der f2－PLGA纳米粒子对过敏性
200510033959.6权 利 要 求 书第1/1页 1、一种应用纳米粒子载体制备尘螨变应原疫苗的方法。具体
地说采用基因工程技术在大肠杆菌中克隆和表达制备重组Der p2/Der f2蛋白。采用复乳-溶媒挥发法制备PLGA包裹的纳米粒子。根据溶液外观评分及扫描电镜观测法判断粒子形态，用颗粒分析仪测定纳米粒子的平均粒径。BCA法测定纳米粒子的包封率、载药量并绘制纳米粒子体外累积释放曲线。通过动物实验证明Der p2/Der f2-PLGA纳米粒子对过敏性哮喘小鼠有作用。
2、根据权利要求1所述的通过复乳-溶媒挥发法制备PLGA包裹的Der p2尘螨重组变应原纳米粒子。
3、根据权利要求1所述的通过复乳-溶媒挥发法制备PLGA包裹的Der f2尘螨重组变应原纳米粒子。
4、根据权利要求1所述Der p2-PLGA纳米疫苗用于过敏性哮喘的。
5、根据权利要求1所述Der f2-PLGA纳米疫苗用于过敏性哮喘的。
6、根据权利要求1所述Der p2-PLGA纳米疫苗和Der f2-PLGA 纳米疫苗联合对过敏性哮喘的。
200510033959.6说 明 书第1/10页一种以纳米粒子为载体制备尘螨变应原疫苗的方法
技术领域
本发明涉及新型疫苗发明领域，具体地说是一种应用纳米粒子为载体制备尘螨变应原疫苗的方法。
背景技术
过敏性疾病(如过敏性哮喘、过敏性鼻炎等)是临床上的常见病和多发病，据2000年WHO/IAACI报告指出近年来哮喘的发病率和死亡率呈上升趋势。全国部分城市对青少年哮喘流行病学统计哮喘发病率为3.3％-5.1％，远较10年前的1％要高；目前我国至少有一千万以上儿童患哮喘。
过敏性疾病是由于各种接触或吸入变应原引起的，变应原大部分为蛋白质，也可为多肽或糖类以及人工合成的物质如药物等。其中粉尘螨和屋尘螨都是强烈的变应原，能引起全身性变态反应包括变应性哮喘、变应性皮炎、变应性荨麻疹等疾病。螨性变应疾病相应约占各种变应疾病的70％左右。2003年全球哮喘防治策略委员会提出全球哮喘病人估计有3亿人。初步估计中国有1000万以上的哮喘儿童，加上成人哮喘全国共有2500万以上的哮喘病人。
关于螨作为哮喘的变应原问题，德国Dekker早在1928年就已提出，但直至1964年才为荷兰Voorhorst等证实尘螨的代谢产物是屋尘中的主要变应原。变应原免疫是唯一的对因方法。我国从
上世纪七十年代初开始了尘螨变态反应的系列研究，进行了大量基础和应用的调查研究，研制并生产了粉尘螨粗浸液疫苗供免疫螨性变态反应疾病并取得一定的疗效。但这种粗浸液尘螨疫苗还存在质量控制难、使用烦琐等不足之处。变应原免疫的研究现在已进入了分子水平，研究表明可以通过调节变态反应疾病的Th1/Th2失平衡状态，将有害的Th2反应转向Th1方向，有利于免疫过敏性哮喘。
新型生物材料的发明和应用引起人们的极大兴趣，如具有热塑性和可溶性的生物可降解材料聚乳酸-聚乙醇共聚物(PLGA)具有良好的生物组织相容性、无毒性和生物可降解性。自1984年Allen等首次证实聚乳酸(P L G A)微粒可作为抗原载体以来，应用P L G A材料制备微米级载药粒子进行口服给药的研究已见诸多报道。应用PLGA 材料作为尘螨变应原载体具有药物保护作用和控制释放等优点，可降低尘螨疫苗的过敏反应、消除传统给药方式的长期性和烦琐性。另外，根据M o o r e和G u t i e r r o等的研究发现P L G A纳米给药系统可以调节变态反应疾病的Th1/Th2失平衡状态，并将有害的Th2反应转向Th1方向，这将比Al(OH)3佐剂更有利于免疫过敏性哮喘。因此，用P L G A为载体制备尘螨变应原疫苗具有新型、安全性和有效性的优点。
尘螨II类变应原Der p2和Der f2最初是由Lind从螨体中提取，Mr为14KD，pI为5.0到8.3。Der p2和Der f2两者氨基酸序列与理化性质均相似，都表现为对热和酸的稳定性。cDNA序列分析与附睾蛋白大部分同源，与过敏性哮喘患者血清IgE的结合率为80％～100％。
它们是尘螨变应原最主要的成份之一。
本发明采用基因工程技术在大肠杆菌中克隆和表达制备重组Der p2和Der f2蛋白，克服了从螨体中大量提取的困难。同时采用PLGA 纳米佐剂制备尘螨重组变应原(Der p2/Der f2)疫苗，用于过敏性哮喘。本发明国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的目的就是利用具有良好的生物组织相容性、无毒性、生物可降解性、可上调T h1免疫反应的聚乳酸-聚乙醇共聚物P L G A作为纳米粒子载体制备新型、安全和有效的尘螨重组变应原疫苗。 本发明采用基因工程技术在大肠杆菌中克隆和表达制备重组Der p2和Der f2蛋白。同时采用复乳-溶媒挥发法制备聚乳酸-聚乙醇共聚物(PLGA)纳米粒子，用纳米粒子包裹重组Der p2/Der f2尘螨变应原制成纳米级尘螨变应原疫苗，并用于过敏性哮喘。该疫苗克服了传统尘螨粗浸液疫苗质量控制难、给药周期长的缺点，另外，还可减少超敏反应的发生。该生产工艺简单，具有经济性和实用性等优点。
本发明包括可以通过以下方式实施。
具体实施方式
本发明的内容，通过以下的实施例作具体说明：
实施例1：用基因工程技术制备重组尘螨变应原D e r f2 基因工程重组表达质粒重组pET-24a(+)/Der f2由深圳大学生命科学学院刘志刚教授课题组构建。将该质粒转化E coli Bl21(DE3)，
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