靶向冠状病毒的抗体及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及靶向冠状病毒的抗体，包括双特异抗体、单域抗体、重链抗体及其应用。

背景技术：

[0002][0003]
冠状病毒为不分节段的单股正链rna病毒，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ和δ四个属，由于病毒包膜上有向四周伸出的突起，形如花冠而得名。2019年发现的新型冠状病毒(sars-cov-2或2019-ncov)属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。目前研究显示， sars-cov-2与sars-cov具有高度同源性。
[0004]
新型冠状病毒肺炎covid-19主要通过呼吸道传染，其也可能通过接触传播。人普遍易感，老年人及有基础疾病者感染后病情较重，儿童及婴幼儿也有发病。基于目前的流行病学调查，新型冠状病毒的潜伏期一般为1-14天，大多数在3-7天。感染者的主要临床症状是发热、乏力、干咳，而鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见。在发病早期，患者的白细胞总数正常或降低，或淋巴细胞数目减少，部分患者出现肝酶、肌酶和肌红蛋白增高的现象。胸部影像显示患者早期呈现多发小斑片影及间质改变，以肺外带明显；进而发展为双肺多发磨玻璃影、浸润影，严重者可出现肺实变，并逐渐出现呼吸困难，严重者发生急性呼吸窘迫综合征(ards)、休克以及肺组织、心脏、肾脏多种组织损伤和功能障碍。多数轻度感染患者预后良好，重度患者病情常常危重，甚至死亡。

技术实现要素：

[0005]
本发明提供对sars-cov-2的spike蛋白具有高亲和力的抗体，包括双特异抗体、单域抗体以及重链抗体或抗原结合片段。
[0006]
本发明提供对sars-cov-2的spike蛋白具有高亲和力的双特异抗体或抗原结合片段。双特异抗体或抗原结合片段可以结合spike蛋白，阻止病毒颗粒和细胞结合以及可以介导免疫细胞吞噬、清除病毒颗粒。双特异抗体或抗原结合片段可用于预防、或改善covid-19，也可以用于诊断covid-19。
[0007]
通过其表面的spike蛋白(s蛋白或棘突蛋白)与肺上皮细胞表面的一种称为血管紧张素转化酶2(ace2)进行结合，sars-cov-2进入细胞内，并利用细胞为其合成新的病毒颗粒；新的病毒颗粒释放到细胞外，再利用同样的方式，病毒感染周围正常的细胞。靶向spike蛋白的双特异抗体或抗原结合片段能阻断spike蛋白与ace2的结合，进而阻断了病毒进入细胞，发挥抗病毒作用。本发明双特异抗体或抗原结合片段还可介导免疫细胞吞噬和清除病毒。
[0008]
一些实施方案提供了靶向冠状病毒的双特异抗体，所述双特异抗体包含通过连接子l1连接的结合spike蛋白的第一结合部分以及结合spike蛋白的第二结合部分。结合
id no:3所示的hcdr2、如seq id no:31所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3。
[0048]
在一些实施方案中，所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如 seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:32所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3。
[0049]
在一些实施方案中，所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如 seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:33所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3。
[0050]
在一些实施方案中，所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如 seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:34所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3。
[0051]
在一些实施方案中，所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:35所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3。
[0052]
在一些实施方案中，所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:36所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3。
[0053]
在一些实施方案中，所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如 seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:37所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3。
[0054]
在一些实施方案中，所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如 seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:38所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3。
[0055]
在一些实施方案中，所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如 seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:39所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3。
[0056]
在一些实施方案中，所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如 seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:40所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3。
[0057]
在一些实施方案中，所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如 seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:41所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3。
[0058]
在一些实施方案中，所述第一结合部分包含如seq id no:2所示的hcdr1、如 seq id no:4所示的hcdr2、如seq id no:42所示的hcdr3、如seq id no:44所示的lcdr1、如seq id no:46所示的lcdr2和如seq id no:48所示的lcdr3。
[0059]
在一些实施方案中，所述第一结合部分包含重链可变区和/或轻链可变区。
[0060]
在一些实施方案中，所述第一结合部分重链可变区的框架区包含重链fr1、重链 fr2、重链fr3和重链fr4；所述重链fr1包含seq id no:49或50所示的序列，或与seq id no:49或50所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:49或 50所示序列相比具有
一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
[0061]
所述重链fr2包含seq id no:51或52所示的序列，或与seq id no:51或52 所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:51或52所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
[0062]
所述重链fr3包含seq id no:53或54所示的序列，或与seq id no:53或54 所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:53或54所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
[0063]
所述重链fr4包含seq id no:55所示的序列，或与seq id no:55所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:55所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0064]
在一些实施方案中，所述重链fr1包含seq id no:49或50所示的序列，或与 seq id no:49或50所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:49或50 所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述重链fr2包含seq idno:51或52所示的序列，或与seq id no:51或52所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:51或52所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述重链fr3包含seq id no:53或54所示的序列，或与seq id no:53或54 所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:53或54所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述重链fr4包含seq id no:55所示的序列，或与seq id no:55所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:55所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，一或多个保守氨基酸取代为约1个、约2个或约3个保守氨基酸取代。
[0065]
在一些实施方案中，所述重链fr1包含seq id no:49所示的序列，所述重链fr2 包含seq id no:51所示的序列，所述重链fr3包含seq id no:53所示的序列，所述重链fr4包含seq id no:55所示的序列。在一些实施方案中，所述重链fr1包含seqid no:50所示的序列，所述重链fr2包含seq id no:52所示的序列，所述重链fr3 包含seq id no:54所示的序列，所述重链fr4包含seq id no:55所示的序列。在一些实施方案中，所述重链可变区包含结构重链fr1-hcdr1-重链fr2-hcdr2-重链 fr3-hcdr3-重链fr4。
[0066]
在一些实施方案中，所述第一结合部分的重链可变区包含如seq id no:49所示的重链fr1、如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:51所示的重链fr2、如 seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:53所示的重链fr3、如seq id no:5-41 中任一项所示的hcdr3和如seq id no:55所示的重链fr4。
[0067]
在一些实施方案中，所述第一结合部分的重链可变区包含如seq id no:50所示的重链fr1、如seq id no:2所示的hcdr1、如seq id no:52所示的重链fr2、如 seq id no:4所示的hcdr2、如seq id no:54所示的重链fr3、如seq id no:42 所示的hcdr3和如seq id no:55所示的重链fr4。
[0068]
在一些实施方案中，所述第一结合部分重链可变区包含seq id no:56或57所示的序列，或与seq id no:56或57所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq idno:56或57所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0069]
在一些实施方案中，所述第一结合部分轻链可变区包含seq id no:58或59所示的序列，或与seq id no:58或59所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq idno:58或
59所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0070]
在一些实施方案中，所述第一结合部分重链可变区包含seqidno:56所示的序列，所述第一结合部分轻链可变区包含seqidno:58所示的序列。
[0071]
在一些实施方案中，所述第一结合部分重链可变区包含seqidno:57所示的序列，所述第一结合部分轻链可变区包含seqidno:59所示的序列。
[0072]
在一些实施方案中，所述第一结合部分还包含重链恒定区、轻链恒定区、fc区或其组合。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ或λ链恒定区。在一些实施方案中，第一结合部分是igg、igm、iga、ige或igd其中一种同种型，或其片段。在一些实施方案中，同种型是igg1、igg2、igg3或igg4，或其片段。在一些实施方案中，第一结合部分中重链恒定区的c-末端被截短。在一些实施方案中，igg1或igg4型的第一结合部分中重链恒定区的c-末端缺少氨基酸残基g和k。没有限制地，所述第一结合部分是嵌合抗体、人源化抗体或是全人源抗体。在某一方面，所述第一结合部分是全人源化抗体。
[0073]
在一些实施方案中，fc是变体fc区。在一些实施方案中，相对于亲本fc区，变体fc区具有一个或多个氨基酸修饰，如取代、缺失或插入。在一些实施方案中，相对于亲本fc区活性，fc区的氨基酸修饰改变了效应功能活性。在一些实施方案中，变体fc区可以具有改变的(即，增加的或降低的)抗体依赖性细胞毒性(adcc)、补体介导的细胞毒性(cdc)、吞噬作用、调理作用或细胞结合。在一些实施方案中，相对于亲本fc区，fc区氨基酸修饰可以改变变体fc区对fcγr(fcγ受体)的亲和力。在一些实施方案中，所述fc区来源于igg1或igg4。在一些实施方案中，fc区突变是n297a。在一些实施方案中，fc区突变是n297a、l234a或l235a(eu编号)。在一些实施方案中，fc区突变是e345r或s440y(eu编号)。
[0074]
在一些实施方案中，所述重链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:60或61所示的序列，或与seqidno:60或61所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:60或61所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
[0075]
所述轻链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:62所示的序列，或与seqidno:62所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:62所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0076]
在一些实施方案中，所述重链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:60或61所示的序列，和/或所述轻链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:62所示的序列。在一些实施方案中，所述重链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:60所示的序列，所述轻链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:62所示的序列。在一些实施方案中，所述重链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:61所示的序列，所述轻链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:62所示的序列。
[0077]
在一些实施方案中，所述第一结合部分包含重链和/或轻链。
[0078]
在一些实施方案中，所述重链包含氨基酸序列如seqidno:71或72所示的序列，或与seqidno:71或72所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:71或72所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
[0079]
所述轻链包含氨基酸序列如seqidno:73或74所示的序列，或与seqidno:73或74所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:73或74所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0080]
在一些实施方案中，所述第一结合部分的重链包含氨基酸序列如seq id no:71 或72所示的序列，和/或所述第一结合部分的轻链包含氨基酸序列如seq id no:73或 74所示的序列。
[0081]
在一些实施方案中，所述第一结合部分的重链包含氨基酸序列如seq id no:71 所示的序列，所述第一结合部分的轻链包含氨基酸序列如seq id no:73所示的序列。在一些实施方案中，所述第一结合部分的重链包含氨基酸序列如seq id no:72所示的序列，所述第一结合部分的轻链包含氨基酸序列如seq id no:74所示的序列。
[0082]
在一些实施方案中，所述重链包含氨基酸序列如seq id no:71中第1位氨基酸至第450位氨基酸或seq id no:72中第1位氨基酸至第451位氨基酸所示的序列，或与seq id no:71中第1位氨基酸至第450位氨基酸或seq id no:72中第1位氨基酸至第451位氨基酸所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:71中第1 位氨基酸至第450位氨基酸或seq id no:72中第1位氨基酸至第451位氨基酸所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
[0083]
所述轻链包含氨基酸序列如seq id no:73或74所示的序列，或与seq id no:73 或74所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:73或74所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0084]
在一些实施方案中，所述第一结合部分的重链包含氨基酸序列如seq id no:71 中第1位氨基酸至第450位氨基酸或seq id no:72中第1位氨基酸至第451位氨基酸所示的序列，和/或所述第一结合部分的轻链包含氨基酸序列如seq id no:73或74 所示的序列。
[0085]
在一些实施方案中，所述第一结合部分的重链包含氨基酸序列如seq id no:71 中第1位氨基酸至第450位氨基酸所示的序列，所述第一结合部分的轻链包含氨基酸序列如seq id no:73所示的序列。在一些实施方案中，所述第一结合部分的重链包含氨基酸序列如seq id no:72中第1位氨基酸至第451位氨基酸所示的序列，所述第一结合部分的轻链包含氨基酸序列如seq id no:74所示的序列。
[0086]
在一些实施方案中，所述第一结合部分包含2条序列相同的重链和2条序列相同的轻链。
[0087]
连接子l1
[0088]
在一些实施方案中，所述连接子l1为包含甘氨酸和丝氨酸的多肽。
[0089]
在一些实施方案中，所述连接子l1的序列为(gms)n，其中每个m独立为2、3、4 或5，n独立为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子l1的序列为(ggggs)n，所述n独立为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子l1为ggggs。在一些实施方案中，所述连接子l1为(ggggs)2，如seq id no:65所示。在一些实施方案中，所述连接子l1为(ggggs)3。在一些实施方案中，所述连接子l1为(ggggs)4，如seq id no:63所示。在一些实施方案中，所述连接子l1为(ggggs)5，如seq idno:64所示。
[0090]
结合spike蛋白的第二结合部分
[0091]
在一些实施方案中，所述第二结合部分为单域抗体。在一些实施方案中，所述单域抗体为vhh。
[0092]
在一些实施方案中，所述第二结合部分为单域抗体，且包含：
[0093]
(a)hcdr1，其包含如seq id no:66所示的氨基酸序列，或其有单一或多个位点取
代、缺失或插入的变体；(b)hcdr2，其包含如seqidno:67所示的氨基酸序列，或其有单一或多个位点取代、缺失或插入的变体；和/或(c)hcdr3，其包含如seqidno:68所示的氨基酸序列，或其有单一或多个位点取代、缺失或插入的变体。
[0094]
在一些实施方案中，所述第二结合部分为单域抗体，且包含：
[0095]
(a)hcdr1，其包含如seqidno:66所示的氨基酸序列，或其有单一或多个位点取代、缺失或插入的变体；(b)hcdr2，其包含如seqidno:67所示的氨基酸序列，或其有单一或多个位点取代、缺失或插入的变体；和(c)hcdr3，其包含如seqidno:68所示的氨基酸序列，或其有单一或多个位点取代、缺失或插入的变体。
[0096]
在一些实施方案中，所述第二结合部分为单域抗体，且包含：
[0097]
(a)hcdr1，其包含如seqidno:66所示的氨基酸序列；(b)hcdr2，其包含如seqidno:67所示的氨基酸序列；和(c)hcdr3，其包含如seqidno:68所示的氨基酸序列。
[0098]
在一些实施方案中，所述单域抗体为vhh。
[0099]
在一些实施方案中，所述单域抗体包含如seqidno:69所示的序列，或与seqidno:69所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:69所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0100]
在一些实施方案中，所述第二结合部分为单域抗体，且包含如seqidno:69所示的氨基酸序列。
[0101]
双特异抗体
[0102]
在一些实施方案中，所述双特异抗体包含上述结合spike蛋白的第一结合部分以及结合spike蛋白的第二结合部分，通过上述连接子l1连接。
[0103]
在一些实施方案中，所述双特异抗体包含以下特征：
[0104]
所述第一结合部分至少包含如seqidno:2所示的hcdr1、如seqidno:4所示的hcdr2、如seqidno:42所示的hcdr3、如seqidno:44所示的lcdr1、如seqidno:46所示的lcdr2和如seqidno:48所示的lcdr3中的一个、两个、三个、四个、五个或全部；和/或
[0105]
所述第二结合部分为vhh，所述第二结合部分至少包含seqidno:66所示的hcdr1、如seqidno:67所示的hcdr2、如seqidno:68所示的hcdr3中的一个、两个或三个；和/或
[0106]
所述第一结合部分的c-末端通过连接子l1与第二结合部分的n-末端进行连接，所述第一结合部分的c-末端为第一结合部分中重链的c-末端或轻链的c-末端；和/或
[0107]
所述连接子l1的氨基酸序列为(ggggs)n，所述n独立为1、2、3、4或5。
[0108]
在一些实施方案中，所述双特异抗体包含以下特征：
[0109]
所述第一结合部分包含如seqidno:2所示的hcdr1、如seqidno:4所示的hcdr2、如seqidno:42所示的hcdr3、如seqidno:44所示的lcdr1、如seqidno:46所示的lcdr2和如seqidno:48所示的lcdr3；和/或
[0110]
所述第二结合部分为vhh，所述第二结合部分包含如seqidno:66所示的hcdr1、如seqidno:67所示的hcdr2、如seqidno:68所示的hcdr3；和/或
[0111]
所述第一结合部分的c-末端通过连接子l1与第二结合部分的n-末端进行连接，所述第一结合部分的c-末端为第一结合部分中重链的c-末端或轻链的c-末端；和/或
[0112]
所述连接子l1的序列为(ggggs)n，所述n独立为1、2、3、4或5。
[0113]
在一些实施方案中，所述第一结合部分重链可变区包含seqidno:57所示的序列，或与seqidno:57所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:57所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0114]
在一些实施方案中，所述第一结合部分轻链可变区包含seqidno:59所示的序列，或与seqidno:59所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:59所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0115]
在一些实施方案中，所述第一结合部分重链可变区包含seqidno:57所示的氨基酸序列，所述第一结合部分轻链可变区包含seqidno:59所示的氨基酸序列。
[0116]
在一些实施方案中，第一结合部分包含重链恒定区、轻链恒定区、fc区或其组合。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ或λ链恒定区。在一些实施方案中，第一结合部分是igg、igm、iga、ige或igd型，或其片段。在一些实施方案中，第一结合部分是igg1、igg2、igg3或igg4型，或其片段。在一些实施方案中，第一结合部分中重链恒定区的c-末端被截短。在一些实施方案中，igg1或igg4型的第一结合部分中重链恒定区的c-末端缺少氨基酸残基g和k。在一些实施方案中，fc是变体fc区。在一些实施方案中，相对于亲本fc区，变体fc区具有一个或多个氨基酸修饰，如取代、缺失或插入。在一些实施方案中，所述第一结合部分为scfv、fab、fab’、f(ab)2或f(ab)2’
。
[0117]
在一些实施方案中，所述第一结合部分和/或第二结合部分是嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。
[0118]
在一些实施方案中，所述第一结合部分重链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:60或61中第1位氨基酸至第328位氨基酸所示的序列，或与seqidno:60或61中第1位氨基酸至第328位氨基酸所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:60或61中第1位氨基酸至第328位氨基酸所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
[0119]
所述第一结合部分轻链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:62所示的序列，或与seqidno:62所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:62所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0120]
在一些实施方案中，所述第一结合部分的重链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:60中第1位氨基酸至第328位氨基酸所示的序列，所述第一结合部分的轻链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:62所示的序列。在一些实施方案中，所述第一结合部分的重链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:61中第1位氨基酸至第328位氨基酸所示的序列，所述第一结合部分的轻链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:62所示的序列。
[0121]
在一些实施方案中，所述第一结合部分重链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:60或61所示的序列，或与seqidno:60或61所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:60或61所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
[0122]
所述第一结合部分轻链恒定区包含氨基酸序列如seqidno:62所示的序列，或与seqidno:62所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:62所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0123]
在一些实施方案中，所述第一结合部分重链恒定区包含如seqidno:60所示的氨基酸序列，所述第一结合部分轻链恒定区包含如seqidno:62所示的氨基酸序列。在一些
实施方案中，所述第一结合部分重链恒定区包含如seqidno:61所示的氨基酸序列，所述第一结合部分轻链恒定区包含如seqidno:62所示的氨基酸序列。
[0124]
在一些实施方案中，所述第二结合部分为vhh。在一些实施方案中，所述第二结合部分包含如seqidno:69所示的序列，或与seqidno:69所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:69所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0125]
一些实施方案中提供了一种双特异抗体，所述双特异抗体包含第一结合部分和单域抗体，且包含以下特征：
[0126]
所述第一结合部分包括重链和轻链；所述第一结合部分的重链包含氨基酸序列如seqidno:72中第1位氨基酸至第451位氨基酸所示的序列，或与seqidno:72中第1位氨基酸至第451位氨基酸所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:72中第1位氨基酸至第451位氨基酸所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
[0127]
所述第一结合部分的轻链包含氨基酸序列如seqidno:74所示的序列，或与seqidno:74所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:74所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
[0128]
所述第一结合部分的重链的c-末端通过如seqidno:63所示连接子l1与单域抗体进行共价连接；和/或
[0129]
所述单域抗体包含如seqidno:69所示的序列，或与seqidno:69所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:69所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的的氨基酸序列。
[0130]
在一些实施方案中，所述第一结合部分的重链包含氨基酸序列如seqidno:72中第1位氨基酸至第451位氨基酸所示的序列，所述第一结合部分的轻链包含氨基酸序列如seqidno:74所示的序列；第一结合部分的重链的c-末端(即ch3末端)通过如seqidno:63所示连接子l1与单域抗体进行共价连接，所述单域抗体包含如seqidno:69所示的序列。
[0131]
一些实施方案中提供了双特异抗体，所述双特异抗体包含第一结合部分和单域抗体，且包含以下特征：
[0132]
所述第一结合部分包含重链和轻链；所述第一结合部分的重链包含氨基酸序列如seqidno:72所示的序列，或与seqidno:72所示的序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:72所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
[0133]
所述第一结合部分的轻链包含氨基酸序列如seqidno:74所示的序列，或与seqidno:74所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:74所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
[0134]
所述第一结合部分的轻链的c-末端通过如seqidno:64所示连接子l1与单域抗体进行共价连接；和/或
[0135]
所述单域抗体包含如seqidno:69所示的序列，或与seqidno:69所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seqidno:69所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的的氨基酸序列。
[0136]
在一些实施方案中，所述第一结合部分的重链包含氨基酸序列如seq id no:72 所示的序列，所述第一结合部分的轻链包含氨基酸序列如seq id no:74所示的序列；第一结合部分的轻链的c-末端(即cl末端)通过如seq id no:64所示连接子l1与单域抗体进行共价连接，所述单域抗体包含如seq id no:69所示的序列。
[0137]
在一些实施方案中，双特异抗体包含第一多肽和第二多肽。在一些实施方案中，双特异抗体包含2条序列相同的第一多肽和2条序列相同的第二多肽。
[0138]
在一些实施方案中，所述第一多肽从n-端至c-端依次包含第一结合部分的重链、连接子l1、单域抗体，或由其组成；所述第二多肽包含轻链，或由其组成。
[0139]
在一些实施方案中，所述第一多肽包含氨基酸序列如seq id no:77所示的序列，或与seq id no:77所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:77所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的的氨基酸序列，或由其组成；和/或
[0140]
所述第二多肽包含氨基酸序列如seq id no:74所示的序列，或与seq id no:74 所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:74所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的的氨基酸序列，或由其组成。
[0141]
在一些实施方案中，所述第一多肽包含氨基酸序列如seq id no:77所示的序列，所述第二多肽包含氨基酸序列如seq id no:74所示的序列。
[0142]
在一些实施方案中，所述第一多肽包含重链，或由其组成；所述第二多肽从n-端至c-端依次包含第一结合部分的轻链、连接子l1、单域抗体，或由其组成。
[0143]
在一些实施方案中，所述第一多肽包含氨基酸序列如seq id no:72所示的序列，或与seq id no:72示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:72示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的的氨基酸序列，或由其组成；和/或
[0144]
所述第二多肽包含氨基酸序列如seq id no:78所示的序列，或与seq id no:78 示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:78示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的的氨基酸序列，或由其组成。
[0145]
在一些实施方案中，所述第一多肽包含氨基酸序列如seq id no:72所示的序列，所述第二多肽包含氨基酸序列如seq id no:78所示的序列。
[0146]
在一些实施方案中，所述双特异抗体为分离的双特异抗体。在一些实施方案中，所述双特异抗体为双特异单克隆抗体。在一些实施方案中，分离的双特异抗体为单克隆抗体。
[0147]
在一些实施方案中，所述双特异抗体第一结合部分特异性结合spike蛋白。在一些实施方案中，所述双特异抗体第二结合部分特异性结合spike蛋白。
[0148]
单域抗体
[0149]
本发明还提供对sars-cov-2的spike蛋白具有高亲和力的单域抗体。单域抗体可以结合spike蛋白，阻止病毒颗粒和细胞结合以及可以介导免疫细胞吞噬、清除病毒颗粒。单域抗体可用于预防、或改善covid-19，也可以用于诊断covid-19。
[0150]
一些实施方案提供了靶向冠状病毒的单域抗体，所述单域抗体包含：
[0151]
(a)hcdr1，其包含如seq id no:66所示的氨基酸序列，或其有单一或多个位点取代、缺失或插入的变体；(b)hcdr2，其包含如seq id no:67所示的氨基酸序列，或其有单一或多个位点取代、缺失或插入的变体；和/或(c)hcdr3，其包含如seq id no:68所示的氨基酸序列，或其有单一或多个位点取代、缺失或插入的变体。
no:65所示。在一些实施方案中，所述连接子l2为(ggggs)3。在一些实施方案中，所述连接子l2为(ggggs)4，如seq id no:63 所示。在一些实施方案中，所述连接子l2为(ggggs)5，如seq id no:64所示。
[0169]
在一些实施方案中，fc区包含氨基酸序列如seq id no:70所示的序列，或与seqid no:70所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:70所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0170]
在一些实施方案中，重链抗体包含氨基酸序列如seq id no:79所示的序列，或与seq id no:79所示序列相比具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:79所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0171]
在一些实施方案中，重链抗体包含氨基酸序列如seq id no:79所示的序列。
[0172]
在一些实施方案中，所述抗体特异性结合spike蛋白。
[0173]
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为分离的抗体或抗原结合片段。
[0174]
示例性氨基酸序列见表1到表4。表1、表3中重链的fc区采用下单划线标出。
[0175]
表1氨基酸序列
[0176]
[0177]
[0178][0179]
表2氨基酸序列
[0180][0181]
表3氨基酸序列
[0182]
[0183][0184]
表4氨基酸序列
[0185]
[0186][0187]
抗体制备方法和表达抗体的核酸序列及细胞
[0188]
本发明还提供了制备所述抗体(包括双特异抗体、单域抗体和重链抗体)的方法，其包括在培养基里培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括纯化所述抗体。纯化可以采用常规方法进行，例如先离心细胞悬液并收集上清液，再次离心进一步去除杂质。proteina亲和柱和离子交换柱等方法可以用于纯化抗体蛋白。
[0189]
本发明还提供了编码所述的抗体(包括双特异抗体、单域抗体和重链抗体)的核酸。在一些实施方案中，所述核酸为分离的核酸。在一些实施方案中，所述核酸序列如表5和表6所示。在一些实施方案中，编码抗体重链seq id no:72的核酸序列如 seq id no:75所示。在一些实施方案中，编码抗体轻链seq id no:74的核酸序列如 seq id no:76所示。在一些实施方案中，编码抗体第一多肽seq id no:77的核酸序列如seq id no:80或83所示。在一些实施方案中，编码抗体第二多肽seq id no:78 的核酸序列如seq id no:81所示。在一些实施方案中，编码重链抗体seq id no:79 的核酸序列如seq id no:82所示。
[0190]
表5核酸序列
[0191]
[0192][0193]
表6核酸序列
[0194]
[0195]
[0196][0197]
本发明还提供了包含所述的核酸的载体。在一些实施方案中，所述载体为分离的载体。在一些实施方案中，包含所述核酸的载体为核酸片段、质粒、噬菌体或病毒。在一些实施方案中，所述载体为分离的质粒。
[0198]
本发明还提供了包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为分离的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为cho细胞、hek293 细胞、cos1细胞、cos7细胞、cv1细胞和鼠l细胞。
[0199]
药物组合物
[0200]
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含所述抗体以及药学上可接受的辅料。
[0201]
应用
[0202]
本发明还提供了方法和用途。在一些实施方案中，提供了用于预防、或改善covid-19的方法，所述方法包括向患者施用有效剂量的所述的抗体(包括双特异抗体、单域抗体和重链抗体)。在一些实施方案中，提供了所述抗体(包括双特异抗体、单域抗体和重链抗体)在预防、或改善covid-19中的应用。在一些实施方案中，提供了所述抗体(包括双特异抗体、单域抗体和重链抗体)在制备用于预防、或改善covid-19的药物中的应用。
[0203]
本发明还提供了诊断方法和用途。在一些实施方案中，提供了检测样品中 sars-cov-2表达的方法，使样品与所述抗体(包括双特异抗体、单域抗体和重链抗体)进行接触，使得所述抗体(包括双特异抗体、单域抗体和重链抗体)结合spike 蛋白，并检测其结合，即样品中spike蛋白的含量。在一些实施方案中，提供了所述抗体(包括双特异抗体、单域抗体和重链抗体)在制备用于诊断covid-19的试剂盒中的应用。在一些实施方案中，提供了包含所述抗体(包括双特异抗体、单域抗体和重链抗体)的诊断试剂盒。
[0204]
本发明提供了靶向冠状病毒的双特异抗体及其应用，双特异抗体中第一结合部分与第二结合部分协同阻止sars-cov-2病毒颗粒侵染细胞，以及介导免疫细胞吞噬、清除病毒颗粒，预防、或改善covid-19；本发明双特异抗体还可以用于诊断检测患者是否感染sars-cov-2。
附图说明
[0205]
图1为部分本发明抗spike蛋白抗体在elisa实验中抑制sars-cov-2与ace2 结合的曲线图。图1中横坐标表示浓度，纵坐标表示od值；其中，1表示抗体1，7 表示抗体7，8表示抗体8，9表示抗体9，12表示抗体12，18表示抗体18，19表示抗体19，20表示抗体20，21表示抗体21，22表示抗体22。
[0206]
图2示抗体阻断spike rbd与ace2的结合；其中，ace2对照组中未添加抗体。
[0207]
图3示抗体阻断病毒侵染小鼠；图中，纵坐标表示肺部病毒滴度。
[0208]
图4示抗体对小鼠体重的影响；图中，纵坐标表示小鼠体重百分含量，横坐标表示天数。
[0209]
术语
[0210]
除非另作说明，否则下列的每一个术语应当具有下文所述的含义。
[0211]
定义
[0212]
应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。
[0213]
本文所用的术语“包含”或“包括”意味着组合物和方法等包括所列举的元素，例如组份或步骤，但不排除其它。“基本上由
……
组成”意味着组合物和方法排除对组合的特征有根本影响的其它元素，但不排除对组合物或方法无本质上影响的元素。“由
……
组成”意味着排除未特别列举的元素。
[0214]
术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的氨基酸单体形成的分子。术语“多肽”是指含两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得，它可能以包括化学合成的任何方式产生。
[0215]“氨基酸”是指既含氨基又含羧基的有机化合物，比如α-氨基酸，其可直接或以前体的形式由核酸编码。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸。天然氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：ala，一字母代码：a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)、谷氨酸(glu，e)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、甲硫氨酸(met， m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、氨酸(trp， w)、酪氨酸(tyr，y)和缬氨酸(val，v)。
[0216]“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被另一个含有化学性质(例如电荷或疏水性)相似的侧链(r基团)的氨基酸残基所取代。一般而言，保守氨基酸取代不大会在实质上改变蛋白质的功能性质。含有化学性质相似侧链的氨基酸类别的实例包括： 1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸。
[0217]“vl、vh、vhh的保守氨基酸取代”的氨基酸数目为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。“重链恒定区、轻链恒定区、重链或轻链、融合蛋白第一多肽或第二多肽的保守氨基酸取代”的氨基酸数目为约1个、约2
个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个、约18个、约19 个、约22个、约24个、约25个、约29个、约31个、约35个、约38个、约41个、约45个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。
[0218]
本发明中关于细胞、核酸、多肽、抗体等所使用的术语“分离的”，例如“分离的”dna、rna、多肽、抗体是指分别于细胞天然环境中的其它组分如dna或rna 中的一种或多种所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组dna技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。分离的多肽、抗体等通常通过至少一个纯化步骤制备。在一些实施方案中，分离的核酸、多肽、抗体等的纯度至少为约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
[0219]
术语“重组”涉及多肽或多聚核苷酸，意指天然不存在的多肽或多聚核苷酸的形式，不受限制的实施例可以通过组合产生通常并不存在的多聚核苷酸或多肽。
[0220]“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性或同一性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的或同一的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。
[0221]“至少80％同一性”为约80％同一性、约81％同一性、约82％同一性、约83％同一性、约85％同一性、约86％同一性、约87％同一性、约88％同一性、约90％同一性、约91％同一性、约92％同一性、约94％同一性、约95％同一性、约98％同一性、约 99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。
[0222]“至少90％同一性”为约90％同一性、约91％同一性、约92％同一性、约93％同一性、约94％同一性、约95％同一性、约92％同一性、约96％同一性、约99％同一性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。核酸或多聚核苷酸序列(或多肽或抗体序列)与另一序列有具有一定百分比(例如90％、95％、98％或者99％)的“同一性”或“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用目测或本领域已知的软件程序来确定该比对同一性百分比或序列同一性，比如ausubel et al.eds.(2007)在current protocols inmolecular biology中所述的软件程序。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的blast，例如blastn和blastp，两者使用下列默认参数： geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10； matrix＝blosum62；descriptions＝50sequences；sortby＝highscore； databases＝non-redundant；genbank+embl+ddbj+pdb+genbankcdstranslations+swissprotein+spupdate+pir。生物学上等同的多聚核苷酸是具有上述指定百分比的同一性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多聚核苷酸。
[0223]
多聚核苷酸是由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)，或当多聚核苷酸是rna时胸腺嘧啶换为尿嘧啶(u)。“多聚核苷酸序列”可以以多聚核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。
[0224]
术语“多聚核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多聚核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是不受限制的多聚核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、est或sage标签)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna、核糖体rna、核糖酶、cdna、dsrna、sirna、 mirna、重组多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、核酸探针和引物。多聚核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多聚核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多聚核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。
[0225]
术语“编码”应用于多核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/ 或其片段。
[0226]“抗体”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或肽。抗体和抗原结合片段包括但不局限实施例所述的重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(cdr)、重链可变区(vh)、轻链可变区(vl)、重链恒定区(ch)、轻链恒定区(cl)、框架区(fr)或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。cdr区包括轻链的cdr区 (lcdr1-3)和重链的cdr区(hcdr1-3)。可变区可包含结构 fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。
[0227]
术语“抗体片段”或“抗原结合片段”指抗体的一部分，例如f(ab’)2、f(ab)2、fab'、 fab、fv、scfv等。不管其结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“抗原结合片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。
[0228]“单链可变片段”或“scfv”是指免疫球蛋白的重链(vh)和轻链(vl)的可变区的融合蛋白。在一些方面，这些区域与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接vh的n端和vl的c端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。scfv分子通常是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。
[0229]
术语“单域抗体”或“sdab”是指具有三个互补决定区(cdr)的单一抗原结合多肽。单独的sdab能够与抗原结合，但不与相应的含cdr多肽配对。在一些情况下， sdab从骆驼hcab工程化，并且其重链可变结构域在本文中称为“vhh”。骆驼sdab 是最小的已知抗原结合抗体片段之一(参见，例如，hamers-casterman等人，nature 363:446-8(1993)；greenberg等人，nature 374:168-73(1995)；hassanzadeh-ghassabeh 等人，nanomedicine(lond),8:1013-26(2013))。
[0230]
术语“重链抗体”或“hcab”是指功能性抗体，其包含重链(vhh、ch2和ch3)，但缺少通常存在于抗体中的轻链。已知骆驼科动物(例如骆驼、美洲驼或羊驼)产生 hcab。
[0231]
在一些实施方案中，双特异抗体中第一结合部分为靶向spike蛋白的抗体，为完整
抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，第一结合部分为igg型抗体。在一些实施方案中，第一结合部分为igg型抗体，且其重链的c-末端被截短。
[0232]
在一些实施方案中，双特异抗体中第二结合部分为靶向spike蛋白的抗体，为完整抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，双特异抗体中第二结合部分为单域抗体。
[0233]
术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为igg、igm、 iga、igg或ige。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、igg5 等已被充分表征并且赋予的功能特异性也已知。所有的免疫球蛋白种类都在本发明公开的保护范围内。在一些实施方案中，免疫球蛋白分子为igg种类。igg通常包含分子量约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽和分子量约为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。这四条链通过二硫键以“y”构型连接，其中轻链从“y”口开始并延续通过可变区包围重链。
[0234]
本发明公开的抗体、抗原结合片段、或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性，全人源、人源化、灵长类化、嵌合抗体/单链抗体、表位结合片段例如fab、 fab'和f(ab')2、fd、fvs、单链fvs(scfv)，二硫键连接的fvs(sdfv)，包含vk或 vh结构域的片段，或由fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗id)抗体。本发明公开的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白的任何类型(例如igg、ige、igm、 igd、iga和igy)或种类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或者亚类。
[0235]
轻链可以分为kappa(κ)或lambda(λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤，b细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从y构型的叉状末端的n末端延伸至每条链底部的c末端。免疫球蛋白κ轻链可变区为vκ；免疫球蛋白λ轻链可变区为v
λ
。
[0236]
轻链和重链都分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”根据功能被使用。轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)决定了抗原识别和特异性。轻链和重链的恒定区赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。n端部分是可变区，c端部分是恒定区；ch3和cl结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
[0237]
如上所述，可变区使得抗体能够选择性识别和特异性结合抗原上的表位。具体而言，抗体的vl结构域和vh结构域或互补决定区(cdr)的子集结合形成了限定三维抗原结合位点的可变区。该抗体四级结构形成存在于y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由vh和vl链中各自的三个cdr(即hcdr1、hcdr2、 hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3)定义。在某些情况下，例如某些来源于骆驼科动物的免疫球蛋白分子或基于骆驼科动物免疫球蛋白改造的免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链组成，没有轻链。例如参见hamers-casterman et al.， nature，363:446-448(1993)。
[0238]
在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“cdr”是形成抗原结合结构域的短的、非连续的与抗原特异性结合的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“构架”区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。构架区大部分采用β-折叠构象，cdr形成与之连接的环状结构，或在
某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使cdr定位在正确的方位上。具有特定位置的cdr的抗原结合域形成了与抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其抗原表位的非共价结合。对于给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以通过已知方法鉴定出包含cdr和框架区的氨基酸(参见kabat,e.,et al.,u.s.department ofhealth andhuman services,sequences ofproteins of immunological interest,(1983)和chothia andlesk,j.mol.biol.,196:901-917(1987))。
[0239]
在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括所有这些含义。一个具体的例子是使用“互补决定区”(“cdr”)一词来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这一特定区域在kabat et al.,u.s.dept.ofhealth and human services,sequences ofproteins of immunological interest(1983)和chothia等在j.mol.biol.196:901-917 (1987)有相关描述，其通过引用全部并入本文。
[0240]
根据kabat和chothia定义的cdr包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来指代抗体或其变体的cdr都在本发明范围内。包含特定 cdr的确切残基编号将根据cdr的序列和大小而变化。本领域技术人员通常可以根据抗体的可变区氨基酸序列确定出cdr包含哪些特定的残基。
[0241]
kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以不依赖于序列本身以外的其他实验数据将该“kabat编号”系统应用到任何可变区序列。“kabat编号”是指由kabat et al.,u.s.dept.ofhealth and human services 在“sequence ofproteins ofimmunological interest”(1983)提出的编号系统。抗体还可以用eu编号系统。
[0242]
本发明公开的抗体或抗原结合片段可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施方案中，可变区可以是软骨鱼纲(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。
[0243]“重链恒定区”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽包括ch1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、ch2结构域、ch3结构域，或变体或片段中的至少一种。例如，本发明公开的抗体或抗原结合片段包含ch1 结构域；包含ch1结构域、至少一部分铰链区以及ch2结构域；包含ch1结构域和 ch3结构域；包含ch1结构域以及至少一部分铰链区以及ch3结构域；或包含ch1 结构域、至少一部分铰链区以及ch2结构域和ch3结构域。在另一实施方案中，本发明公开的抗体或抗原结合片段包含ch3结构域。此外，本发明中使用的抗体或抗原结合片段可能缺部分或全部ch2结构域。如上所述，本领域普通技术人员应当理解，重链恒定区可以被修饰从而使得它们天然存在的免疫球蛋白分子的氨基酸序列发生变化。
[0244]
抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包括源自igg1分子的ch1结构域和源自igg3分子的铰链区。在另一实施方案中，重链恒定区可以包括部分源自igg1分子和部分源自igg3分子的铰链区。在另一实施方案中，部分重链可以包括部分源自igg1分子和部分源自igg4分子的嵌合铰链区。
[0245]“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结
构域或恒定λ结构域中的至少一个。“轻链-重链对”是指可通过轻链的cl结构域和重链的ch1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。
[0246]
如上所述，各种免疫球蛋白种类的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。“vh结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，“ch1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(大部分氨基末端)恒定区。ch1结构域与vh结构域相邻，并且是免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基端。ch2结构域不与其它结构域紧密配对，而是在完整的天然igg分子的两个ch2结构域之间插入两个n-连接的分支碳水化合物链。 ch3结构域从ch2结构域开始延伸到igg分子的c-末端，大约包含108个残基。“铰链区”包括连接ch1结构域和ch2结构域的部分重链区域。所述铰链区包含约25个残基并且是有韧性的，从而使得两个n端抗原结合区能够独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(roux et al.,j.immunol161:4083(1998))。
[0247]“二硫键”指两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸的硫醇基团可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接。在大多数天然存在的igg分子中，ch1和cl区通过二硫键连接，两条重链通过两个二硫键在kabat编号系统中对应的位置239和242(eu编号系统位置226和229)处相连接。
[0248]“嵌合抗体”指其可变区从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。某些实施方案中，可变区来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区来自人源。
[0249]“特异性结合”或“对
……
具有特异性”通常是指抗体或抗原结合片段与特定抗原通过其抗原结合结构域与表位互补性结合形成相对稳定的复合物。“特异性”可以用抗体或抗原结合片段与特定抗原或表位结合的相对亲和力表达。例如，如果抗体“a”比抗体“b”与同一抗原的相对亲和力大，可以认为抗体“a”比抗体“b”对该抗原具有更高的特异性。特异性结合可以用平衡解离常数(kd)来描述，较小的kd意味着较紧密的结合。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域内众所周知的，并包括例如平衡透析、表面等离子共振、生物膜层光学干涉测量法等。“特异性结合”spike蛋白的抗体包括与spike蛋白平衡解离常数kd小于或等于约100nm、小于或等于约10nm、小于或等于约5nm、小于或等于约1nm。单特异抗体可特异性结合一个抗原或一个表位，而双特异抗体可特异性结合两个不同的抗原或两个不同的表位。
[0250]“”是指性和预防性或防治性措施，其目的是预防、减缓、改善或停止不良的生理改变或紊乱，例如疾病的进程，包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善、缓和、减轻或消失(无论是部分还是全部)、延长与不接受时预期的生存期限等。需要的患者包括已经患有病症或紊乱的患者，容易患有病症或紊乱的患者，或者需要预防该病症或紊乱的患者，可以或预期从施用本发明公开的抗体或药物组合物用于检测、诊断过程和/或中受益的患者。
[0251]“患者”指需要诊断、预后或的任何哺乳动物，包括人类、狗、猫、兔子、大鼠、小鼠、马、牛等。
[0252]“约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方式中，本文中提到“约”指所描述的数值以及其
±
10％、
±
5％或
±
1％的范围。
[0253]“ecmo”即指体外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation，ecmo)，其是一种医疗急救技术设备，主要用于对重症心肺功能衰竭患者提供持续的体外呼吸与循环，以维持患者生命。
[0254]“icu”是指重症加强护理病房(intensive care unit)，、护理、康复均可同步进行，为重症或昏迷患者提供隔离场所和设备，提供最佳护理、综合、医养结合，以及术后早期康复、关节护理运动等服务。
[0255]“imv”即指间歇性指令通气(intermittent mandatory ventilation)，其是根据预先设置的时间间隔即时间触发，来实施周期性的容量或压力通气。这期间允许患者在指令通气期间以任何设定的基础压力水平进行自主呼吸。在自主呼吸时，患者可以在持续气流支持下自主呼吸，或者机器将按需阀门打开以允许自主呼吸。据大多数呼吸机都可以在自主呼吸时提供压力支持。
[0256]“hfnc”即经鼻高流量氧疗(high-flow nasal cannula oxygen therapy)，其是通过无需密封的鼻塞导管直接将一定氧浓度的空氧混合高流量气体输送给患者的一种氧疗方式，作为一种无创呼吸支持的形式，其能迅速地改善氧合。目前可以应用于急性低氧性患者、外科手术后患者、未行气管插管患者、免疫抑制患者、心功能不全患者等。
[0257]“niv”即指无创通气(non-invasine ventilation)，是指除气管插管、气管切开以外的无创伤的机械通气。
[0258]“ec
50”即半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect,ec
50
)是指能引起50％最大效应的浓度。
[0259]“ic
50”表示50％抑制浓度，即对指定的生物过程抑制一半时所需的药物或者抑制剂的浓度。
[0260]
本发明中“亲本fc区”可以为天然存在的fc区，编码fc区的基因可来自人、鼠、兔、骆驼、猴子，优选为人和小鼠；例如，亲本fc区为seq id no:60、seq id no:61 或seq id no:66中fc区。
[0261]
本文提及专利、出版物的相关描述均通过引用全部并入本文。
[0262]
双特异抗体、单域抗体和重链抗体
[0263]
本发明提供了对spike蛋白具有高亲和力的抗体，包括双特异抗体、单域抗体和重链抗体。双特异抗体、单域抗体和重链抗体表现出有效的结合活性，并可用于和诊断用途。比如，这些抗体可以阻止sars-cov-2病毒颗粒和细胞膜融合，以及介导免疫细胞吞噬、清除病毒颗粒。
[0264]
一些实施方案提供了双特异抗体，双特异抗体中第一结合部分的重链的c-末端(即 ch3末端)通过连接子l1与单域抗体进行共价连接。在一些实施方案中，双特异抗体包含2条序列相同的第一多肽和2条序列相同的第二多肽；所述第一多肽的氨基酸序列如seq id no:77所示，所述第二多肽的氨基酸序列如seq id no:74所示。
[0265]
一些实施方案提供了双特异抗体，双特异抗体中第一结合部分的轻链的c-末端(即 cl末端)通过连接子l1与单域抗体进行共价连接。在一些实施方案中，双特异抗体包含2条序列相同的第一多肽和2条序列相同的第二多肽；所述第一多肽的氨基酸序列如seq id no:72所示，所述第二多肽的氨基酸序列如seq id no:78所示。
[0266]
一些实施方案提供了单域抗体，单域抗体的氨基酸序列如seq id no:69所示。
[0267]
一些实施方案提供了重链抗体，重链抗体含有2条序列相同的重链，其重链序列如seq id no:79所示。
[0268]
在一些实施方案中，双特异抗体、单域抗体或重链抗体还可连接氨基酸序列或一个或多个修饰基团。例如，本发明公开的双特异抗体、单域抗体或重链抗体可以包含有韧性的接头序列，或者可以被修饰以添加功能性基团(例如peg、药物、毒素或标签)。
[0269]
本发明公开的双特异抗体、单域抗体或重链抗体还包含被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体的共价连接进行修饰，其中共价连接不会阻止抗体与表位结合。包括但不限制以下实例，抗体可以被糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白质等。众多化学修饰中的任一种修饰可以通过现有技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
[0270]
在一些实施方案中，双特异抗体、单域抗体或重链抗体可以与剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调节剂、药剂或peg进行缀合。
[0271]
双特异抗体、单域抗体或重链抗体可以与剂缀合或融合，所述剂可包括可检测标记，如放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏剂、诊断剂、细胞毒性剂、超声增强剂、非放射性标记物及其组合物，和本领域已知的其它此类试剂。
[0272]
双特异抗体、单域抗体或重链抗体可通过将其偶联至化学发光化合物来被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光从而确定化学发光标记的抗体的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
[0273]
本发明还公开了编码本发明所述双特异抗体、单域抗体和重链抗体的多聚核苷酸或核酸分子。本发明公开的多聚核苷酸可以编码重链、轻链、重链可变区、轻链可变区、fc区、部分重链可变区或部分轻链可变区、双特异、单域抗体或重链抗体。制备抗体的方法是本领域公知的并且在本发明中有所描述。在某些实施方案中，本发明公开的抗体的可变区和恒定区都是全人源的。全人源抗体和抗原结合片段可以使用本领域中公开的技术和本发明所述的技术制备。例如，针对特定抗原的全人源抗体可以通过将抗原施用于转基因动物中来制备，所述转基因动物已经被改良过以响应抗原攻击而产生全人源抗体。可用于制备这种抗体的示例性技术参见美国专利6,458,592； 6,420,140，其全部内容通过引用并入本文。
[0274]
在某些实施方案中，制备的抗体不会在待的动物(例如人类)中引起有害的免疫应答。在一实施方案中，本发明公开的抗体(包括双特异抗体、单域抗体或重链抗体)使用本领域公认的技术修饰以降低其免疫原性。例如，抗体可以被人源化、灵长类化、去免疫化或者可以制备嵌合抗体。这些类型的抗体来源于非人抗体，通常是鼠类或灵长类抗体，其保留或基本保留亲本抗体的抗原结合特性但在人体中免疫原性较低。其可以通过多种方法来实现，包括(a)将整个非人源的可变区移植到人源的恒定区以产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类互补决定区(cdr)的至少一部分移植到人源的框架和恒定区中，保留或不保留关键的框架残基；或(c)移植整个非人源的可变区，但通过用类人源的部分置换表面残基从而“隐藏”它们。通常人框架区中的框架残基将被来自cdr供体抗体的相应残基取代，比如能
够改善抗原结合的残基。这些框架替换可以通过本领域公知的方法鉴定，例如通过模拟cdr和框架残基的相互作用以鉴定对抗原结合起重要作用的框架残基和通过序列对比以鉴定特定位置上异常的框架残基。(参考美国专利5,585,089；其全部内容通过引用并入本文)。可以使用本领域公知的多种技术使抗体人源化，例如cdr移植(ep 239,400；wo 91/09967；美国专利5,225,539,5,530,101和5,585,089)，修复或者表面重排(ep592,106；ep519,596)，以及链的重排(美国专利5,565,332)，其全部内容通过引用并入本文。
[0275]
去免疫化也可用于降低抗体的免疫原性。在本发明中，术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰t细胞表位(参见例如wo/9852976a1和wo/0034317a2)。例如，分析来自起始抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列，并产生来自每个可变区的人t细胞表位“图谱”，显示表位相对于互补决定区(cdrs)和序列内其它关键残基的位置。分析来自t细胞表位图的单个t细胞表位，以鉴定具有较低改变抗体活性风险的可选择的氨基酸取代。设计包含氨基酸取代组合的一系列可选的重链可变区序列和轻链可变区序列，随后将这些序列掺入到一系列结合多肽中。然后将包含修饰过的可变区和人类恒定区的完整重链和轻链的基因克隆到表达载体中，随后将质粒转入细胞系以产生完整的抗体。然后利用合适的生物化学和生物学实验中比较抗体，鉴定出最佳的抗体。
[0276]
本发明公开的抗体的结合特异性可以通过体外实验，例如免疫共沉淀、放射免疫实验(ria)或酶联免疫吸附实验(elisa)来检测。
[0277]
scfv的制备可参见生产单链单元的技术(美国专利4,694,778)。通过氨基酸桥接 fv区的重链和轻链片段形成单链单元，产生单链融合肽。也可以使用在大肠杆菌中组装功能性fv片段的技术(skerra et al.,science 242:1038-1041(1988))。
[0278]
可用于生产单链fv(scfv)和抗体的技术的实例包括如美国专利4,946,778和 5,258,498中所述。对于包括在人体内使用抗体和体外检测实验的某些用途，可以使用嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。嵌合抗体是抗体的不同部分源自不同动物物种的一类分子，例如具有鼠源单克隆抗体的可变区和人源免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的，参见美国专利5,807,715、4,816,567和4,816,397，其全部内容通过引用并入本文。
[0279]
针对特定抗原或靶标的天然存在的vhh域可获自骆驼科vhh序列的(原生或免疫)文库。这样的文库和技术例如描述于wo 99/37681、wo 01/90190、wo 03/025020 和wo 03/035694。或者，可使用来源于(原生或免疫)vh库的改进合成或半合成文库，例如通过例如随机诱变和/或cdr改组的技术获自(原生或免疫)vh库的vhh 文库，例如wo 00/43507中所述。
[0280]
此外，在newman,biotechnology 10:1455-1460(1992)中公开了另一种生产重组抗体的高效方法，特别地，该技术能产生含有猴可变区和人恒定区序列的灵长类抗体，该参考文献的全部内容通过引用并入本文。此外，该技术也在共同转让的美国专利 5,658,570、5,693,780和5,756,096中有所提及，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
[0281]
抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用来自免疫球蛋白序列的抗体文库进行的噬菌体展示方法。也可参考美国专利4,444,887和4,716,111，以及pct公布文本wo 98/46645、wo 98/50433、wo 98/24893、wo 98/16654、wo 96/34096、 wo 96/33735和wo 91/10741，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
[0282]
在另一实施方案中，使用常规方法(例如使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以分离编码所需单克隆抗体的dna并对其进行测序。分离的和亚克隆的杂交瘤细胞可以作为此类dna的来源。一旦分离出来，dna 可以被置于表达载体中，然后被转染到原核或真核宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴cos 细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或不产生其他免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中。分离的 dna(如本文所述可以是合成的)也可用于制备抗体的恒定区和可变区的序列，如美国专利5,658,570中所述，其全部内容通过引用并入本文。该方法从所选细胞中提取 rna并转化成cdna，然后使用ig特异性引物通过pcr技术进行扩增。适于此目的的合适的探针在美国专利5,658,570中也有所提及。
[0283]
此外，使用常规重组dna技术，可将本发明的抗体的一个或多个cdr插入框架区，例如插入到人类框架区以构建人源化非全人源抗体。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，优选人类框架区(参见chothia et al.,j.mol.biol.278:457-479(1998)，其列出一系列人类框架区)。一些多核苷酸可以编码框架区和cdr组合产生的与目标抗原的至少一个表位特异性结合的抗体。在框架区内可以进行一个或多个氨基酸取代，可以选择能够改善抗体与其抗原结合的氨基酸取代。另外，可用此法进行参与链间二硫键形成的一个或多个可变区中半胱氨酸残基的取代或缺失，从而产生缺少一个或多个链间二硫键的抗体分子。本领域技术范围内的对多核苷酸进行的其他改变也涵盖于本发明中。
[0284]
在一些实施方案中，可以按常规方法根据本文所述抗体的氨基酸序列设计合成编码抗体的dna，将其置入表达载体中，然后转染宿主细胞，在培养基中培养被转染的宿主细胞产生抗体。在一些实施方案中，表达载体包括至少一个启动子元件，抗体、抗原结合片段或融合蛋白编码序列，转录终止信号和polya尾。其他元件包括增强子， kozak序列及插入序列两侧rna剪接的供体和受体位点。可以通过sv40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如rsv、htlv1、hivi及巨细胞病毒 (cmv)的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pires1neo，pretro-off，pretro-on，plxsn，或者plncx，pcdna3.1(+/-)，pcdna/zeo(+/-)，pcdna3.1/hygro(+/-)，psvl， pmsg，prsvcat，psv2dhfr，pbc12mi，pcs2或pcho1.0等。常使用的哺乳动物细胞包括hek293细胞、cos1细胞、cos7细胞、cv1细胞、鼠l细胞和cho细胞等。
[0285]
在一些实施方案中，插入基因片段需含有筛选标记，常见的筛选标记包括二氢叶酸还原酶，谷氨酰胺合成酶，新霉素抗性，潮霉素抗性等筛选基因，以便于转染成功的细胞的筛选分离。将构建好的质粒转染到无上述基因的宿主细胞，经过选择性培养基培养，转染成功的细胞大量生长，产生想要获得的目的蛋白。
[0286]
此外，可以使用本领域技术人员已知的标准技术在编码本发明所述抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于导致氨基酸取代的定点突变和pcr介导的突变。变体 (包括衍生物)编码相对于原重链可变区hcdr1、hcdr2、hcdr3和轻链可变区 lcdr1、lcdr2或lcdr3来说少于50个氨基酸的取代、少于40个氨基酸的取代、少于30个氨基酸的取代、少于25个氨基酸的取代、少于20个氨基酸的取代、少于15个氨基酸的取代、少于10个氨基酸的取代、少于5个氨基酸的取代、少于4个氨基酸的取代、少于3个氨基酸的取代或少于2个氨基酸的取代。或者可以沿着全部或部分编码序列时随机引入突变，例如通过饱和突变，以及可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。在一些实施方案中，取代可以为保守氨基酸取代。
[0287]
方法
[0288]
本发明还提供了方法和用途。在一些实施方案中，提供了用于预防、或改善covid-19的方法，所述方法包括向患者施用有效剂量的抗体(包括双特异抗体、单域抗体或重链抗体)。在一些实施方案中，提供了所述抗体(包括双特异抗体、单域抗体或重链抗体)在预防、或改善covid-19中的应用。在一些实施方案中，提供了所述抗体(包括双特异抗体、单域抗体或重链抗体)在制备用于预防、或改善covid-19的药物中的应用。在一些实施方案中，所述患者为疑似感染 sars-cov-2病毒的患者。在一些实施方案中，所述患者为与sars-cov-2病毒携带者有接触的患者。在一些实施方案中，所述患者为确诊感染sars-cov-2病毒的患者。在一些实施方案中，所述患者为有轻微症状的患者。在一些实施方案中，所述患者为有严重症状的患者。在一些实施方案中，所述患者有发热，咳嗽，低血压，缺氧，和/ 或急性呼吸窘迫综合征(ards)。
[0289]
对于任何特定患者的具体剂量和方案将取决于各种因素，包括所使用的抗体 (包括双特异抗体、单域抗体或重链抗体)、患者的年龄和体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、排泄频率、药物组合，以及所的特定疾病的严重程度。由包括在本领域普通技术人员范围内的医疗护理人员对这些因素进行判断。所述剂量还将取决于待的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度以及所需的效果。所用剂量可以通过本领域熟知的药理学和药代动力学原理确定。
[0290]
抗体(包括双特异抗体、单域抗体或重链抗体)施用方法包括但不限于真皮内、肌肉、腹腔、静脉、皮下、鼻腔、硬脊膜外和口服注射。药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂共同施用。因此，含有本发明的抗体的药物组合物可以口服给药、直肠给药、肠胃外给药、脑池内给药、阴道内给药、腹腔内给药、外敷(如通过粉末，软膏，滴剂或透皮贴剂)、口腔给药或通过口服或鼻腔喷雾给药。
[0291]
本发明使用的术语“肠胃外”是指包括静脉内、肌肉内、鼻腔内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。施用方式可以是全身施用或局部施用。
[0292]
在一些实施方案中，本发明组合物包含编码蛋白质的核酸或多聚核苷酸，可以通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分来体内施用所述核酸以促进其编码的蛋白质的表达，然后通过下述方式施用上述部分载体使其变为胞内部分，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因；biolistic，dupont)，或用脂质体或细胞表面受体或转染试剂包被，或者通过与已知进入细胞核的同源异型盒类肽连接施用(参见例如joliot et al.,1991,proc. natl.acad.sci.usa 88:1864-1868)等等。可选地，核酸可以通过同源重组在引入细胞内并整合至宿主细胞dna中用于表达。
[0293]
在一些实施方案中，本发明的抗体，包括双特异抗体、单域抗体或重链抗体施用于患者的剂量为0.01mg/kg至100mg/kg患者体重，或0.1mg/kg至20mg/kg患者的体重。每次给药可相隔至少1天至3天；或至少一星期。可以通过例如脂质化等修饰来增强抗体的摄取和组织穿透能力(例如进入脑内)，从而减少本发明抗体的施用的剂量和频率。
[0294]
各种已知输送系统可用于施用本发明双特异抗体、单域抗体或重链抗体或其编码多核苷酸，例如包封于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的
内吞作用(参见例如wu and wu,1987,j.biol.chem.262:4429-4432)、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建等。
[0295]
联合疗法
[0296]
在一些实施方案中，本发明抗体，包括双特异抗体、单域抗体或重链抗体可以结合其它或预防方案，包括施用一种或多种本发明抗体以及一种或多种其它剂或方法一起使用或组合使用。对于组合，本发明抗体可以与其它剂可同时或分开施用。当分开施用时，可以在施用另一种其它剂之前或之后施用本发明抗体。
[0297]
在一些实施方案中，与本发明抗体联合用药的剂为以下中的一种：hiv药物、抗疟药、rna聚合酶抑制剂、抗病毒药物和单抗类药。在一些实施方案中，hiv药物包括洛匹那韦/利托那韦，asc09/利托那韦和达芦那韦；不推荐单独使用洛匹那韦/利托那韦和利巴韦林。在一些实施方案中，抗疟药包括磷酸氯喹。在一些实施方案中，抗病毒药物包括阿比多尔、法匹拉韦和α-干扰素。在一些实施方案中，单抗类药物包括bdb-001。
[0298]
一些新型冠状病毒肺炎重型或危重型患者存在细胞因子风暴现象，本发明抗体可与阿达木单抗(adalimumab，例如修美乐与阿达木单抗(adalimumab，例如修美乐及其生物类似物，如abrilada
tm (adalimumab-afzb)，amjevita(adalimumab-att)，cyltezo
tm
(adalimumab-adbm)，hyrimoz
tm (adalimumab-adaz)，hulio
tm
，格乐立(bat1406))或托珠单抗(tochilizumab, 例如雅美罗雅美罗及其生物类似物，如bat1806)联合用于，其可以减缓tnf-α表达上调导致的炎症反应。在一些实施方案中，本方法的患者被确诊感染新型冠状病毒并且有一种或多种细胞因子(包括肿瘤坏死因子α(tnf-α)， ifn-γ、il-1β、il-2、il-4、il-7、il-8、il-10、il-12p70、il-13、粒细胞集落刺激因子(gscf)、干扰素诱导蛋白-10(ip-10)、单核细胞趋化蛋白-1(mcp1)、巨噬细胞炎性蛋白1α(mip1a))增高。在一些实施方案中，本方法的患者有tnf-α增高。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子高于正常水平至少50％。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子至少为正常水平的2倍、3倍或4倍。在一些实施方案中，本方法前患者有发热，低血压，缺氧，和/或急性呼吸窘迫综合征(ards)。在一些实施方案中，本方法前患者有肺部充满炎性液体(即所谓的“白肺”)。在一些实施方案中，本方法前患者有细胞因子风暴引起的细胞因子释放综合症 (cytokine release syndrome，crs)。
[0299]
在一些实施方案中，本发明抗体用于结合icu。在一些实施方案中，本发明抗体结合体外ecmo和/或imv。在一些实施方案中，本发明抗体结合氧疗。在一些实施方案中，本发明抗体结合niv/hfnc。在一些实施方案中，后，患者的一种或多种细胞因子比前至少降低20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、90％、或95％。在一些实施方案中，本方法使患者痊愈。
[0300]
诊断方法
[0301]
在某些样品中观察到spike蛋白的阳性，或者被sars-cov-2病毒感染了的患者可能对使用本发明抗体的有响应。因此，本发明抗体也可以用于检测和诊断。
[0302]
样品可以从患者体内获得。在选择性地对样品进行预处理之后，可以在允许抗体与可能存在于样品中的spike蛋白相互作用的条件下，将样品与本发明抗体一起孵育。可以使用诸如elisa的方法，利用抗体来检测样品中spike蛋白的存在。
[0303]
样品中spike蛋白的存在(比如含量或浓度)可以用于诊断相关疾病，作为患者适
用抗体的指示，或作为患者已经(或没有)对病症作出反应的指示。对于预后方法，可以在开始疾病时在特定阶段进行一次、两次或更多次地检测，以指示的进展。
[0304]
药物组合物
[0305]
本发明还提供了药物组合物。这样的组合物包含有效剂量的抗体以及药学上可接受的辅料。
[0306]
在一些实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由政府的监管机构批准的或其他公认的药典中列出的用于动物(特别是用于人类)的物质。此外，“药学上可接受的辅料”通常指是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂等。
[0307]
术语“辅料”是指可以与活性成分一起施用于患者的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，药物组合物还可以含有少量的润湿剂、乳化剂，或ph缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂如乙二胺四乙酸，以及调节张力的试剂如氯化钠或右旋葡萄糖也是可以预见的。这些药物组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。该药物组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在e.w.martin的 remington's pharmaceutical sciences中有描述，在此通过引用并入本发明。此类组合物将含有临床有效剂量的抗体或抗原结合片段，优选以纯化后的形式，连同合适数量的载体，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
[0308]
在一些实施方案中，根据常规步骤将组合物配制成适合静脉内注射于人体的药物组合物。用于静脉内给药的组合物通常是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。药物组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分以单位剂量形式单独供给或混在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在可指示活性剂份量的密封容器(如安瓿瓶、西林瓶或或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药用级水、生理盐水或者葡萄糖注射液的输液瓶或者输液袋来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或生理盐水或葡萄糖注射液的安瓿瓶或者西林瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。
[0309]
本发明的化合物可以配制成中性的或盐的形式。药学上可接受的盐包括衍生自如与盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐，以及衍生自如与钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子形成的盐。
具体实施方式
[0310]
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发
明的保护范围。
[0311]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0312]
实施例1抗spike蛋白抗体的制备
[0313]
抗体(包括单特异抗体、双特异抗体、单域抗体和重链抗体)可以通过以下方法或其他已知方法制备：依照宿主细胞cho密码子偏好性特点进行序列优化，由氨基酸序列得到dna序列。将优化并合成的序列分别克隆入载体，然后分别抽提大量质粒，进行稳定表达细胞株的构建：线性化的表达载体与cho细胞混匀后加入0.4cm电转杯进行电转；电转完成后，按1200个细胞每孔铺到96孔细胞培养板，约2-3周后选择表达量高的母克隆进行96孔到24孔到6孔到摇瓶的细胞扩大培养和表达量检测，选择摇瓶表达量高的克隆进行亚克隆，亚克隆扩大培养和表达鉴定同母克隆，根据表达量水平和细胞株稳定性选择单克隆稳定细胞株，悬浮培养12天左右收获上清，进行 proteina亲和捕获，阴离子及阳离子层析获得纯度大于95％的抗体。
[0314]
示例性抗体1-23和2f8的可变区组成见表7，vh与ch(如seq id no:61所示) 组成抗体的重链，vl与cl(如seq id no:62所示)组成抗体的轻链；其中，抗体 2f8(单特异抗体)含有两条序列相同的重链(如seq id no:72所示)和两条序列相同的轻链(如seq id no:74所示)，其重链对应的核酸序列如seq id no:75所示，其轻链对应的核酸序列如seq id no:76所示；单域抗体vhh18的氨基酸序列如seqid no:69所示；重链抗体vhh18-fc含有2条序列相同的重链(如seq id no:79所示)，重链由单域抗体、连接子l2和fc组成，其重链对应的核酸序列如seq id no:82 所示；双特异抗体2f8-vh-vhh18含有两条序列相同的第一多肽(如seq id no:77 所示)和两条序列相同的第二多肽(如seq id no:74所示)，第一多肽由重链、连接子l1和单域抗体组成，第二多肽由轻链组成，其第一多肽对应的核酸序列如seq idno:83所示，其第二多肽对应的核酸序列如seq id no:76所示；双特异抗体 2f8-vl-vhh18含有2条序列相同的第一多肽(如seq id no:72所示)和2条序列相同的第二多肽(如seq id no:78所示)，第一多肽由重链组成，第二多肽由轻链、连接子l1和单域抗体组成，其第一多肽对应的核酸序列如seq id no:75所示，其第二多肽对应的核酸序列如seq id no:81所示。
[0315]
纯化后的抗体经测序证实序列如上所述。
[0316]
表7抗spike蛋白抗体(单特异抗体)的重链可变区和轻链可变区
[0317]
[0318][0319]
实施例2抗体与sars-cov-2 spike蛋白结合活性的检测
[0320]
针对上述抗体进行elisa检测，检测方法为：将96孔板(corning，9018)用 spike-rbd-mfc(sino biologicals)包被，并用胶带密封并储存；将板在清洗缓冲液pbst (含0.05％tween 20的pbs)中清洗3次，之后加入封闭溶液(每孔200μl的10mg/mlbsa，溶剂为清洗缓冲液)；孵育(1小时(h)，37℃)后，将板用清洗缓冲液洗涤3次，然后每孔添加梯度稀释好的样品100μl；孵育(1.5h，37℃)后，将板用清洗缓冲液洗涤，然后加入抗人κ轻链抗体-过氧化物酶偶联物(在封闭溶液中稀释至1:2000，100μl/ 孔)；将板用清洗缓冲液洗涤，在添加100μltmb(tetramethylbenzidine，biopandatmb-s-001)底物/孔之前，将测试样品孵育(1h，37℃)；显10分钟后，加入100μl/ 孔0.1mh2so4终止反应，然后在450nm的吸光度下测量96孔板。
[0321]
通过吸光值计算ec
50
，各种单特异抗体与sars-cov-2spike蛋白结合的ec
50
值见表8。
[0322]
表8
[0323][0324]
[0325]
实施例3抗体阻断sars-cov-2 spike蛋白与血管紧张素转化酶2结合
[0326]
1)针对上述某些抗体进行竞争elisa以检测其阻断spike蛋白与血管紧张素转化酶 2(ace2)结合的能力。检测方法为：将96孔板(corning，9018)用spike-rbd-mfc (sino biologicals)包被，并用胶带密封并储存4℃过夜；将板在清洗缓冲液(含0.05％ tween 20的pbs)中清洗3次，之后加入封闭溶液(每孔200μl的10mg/ml bsa，溶剂为清洗缓冲液)；孵育(2h，37℃)后，将板在清洗缓冲液中清洗3次，加入不同浓度的抗体样品，然后加入生物素化的血管紧张素转化酶2(50ng/ml)；孵育(1h， 37℃)后，将板用清洗缓冲液洗涤3次，然后每孔添加100μl链霉亲和素过氧化物酶偶联物(在封闭溶液中稀释1:10,000)，孵育(1h，37℃)后，将板用清洗缓冲液洗涤，加100μl/孔tmb底物；显10分钟后，加入50μl/孔0.1m h2so4终止反应，在450 nm的吸光度下测量吸光值。
[0327]
上述各种抗体阻断covid-19spike蛋白与ace2结合的曲线图见图1。
[0328]
2)采用spr(表面等离子共振)技术进行检测：先将100nm biotinylated spike rbd (acrobiosystems，spd-c82e9)蛋白结合在streptavidin探针上，结合了biotinylated spikerbd的探针与100nm抗体溶液进行孵育，将捕获了抗体的探针与100nmace2(近岸生物，c419)蛋白进行孵育，以便检测已经结合了抗体的spike rbd蛋白是否还可以与溶液中的ace2进行结合。
[0329]
如图2显示，抗体2f8和2f8-vh-vhh18可阻断ace2与spike rbd的结合，抗体vhh18-fc可部分阻断ace2与rbd的结合。
[0330]
实施例4抗体与spike蛋白亲和力的测定
[0331]
biacore t200(ge healthcare)(生物分子相互作用分析)在25℃进行检测：采用proteina芯片进行检测，抗体使用1
×
hbs ep+进行稀释(0.1m hepes，1.5m nacl， 0.03m edta，再补充0.005％表面活性剂p20)，以10μl/min的流速通过实验流路(fc2、 fc4)，进行捕获；之后流速调为30μl/min，依次分析不同浓度spike s1 rbd及突变体的稀释液(0nm、3.125nm、6.25nm、12.5nm、25nm和50nm，用1
×
hbs ep+稀释)，同时流经实验流路(fc2、fc4)和参比流路(fc1、fc3)表面，进行结合、解离，最后进ph 1.5glycine缓冲液对芯片进行再生并进入下一个循环。在biacore dataanalysis软件上使用1:1langmuir结合模型计算动力学常数spike trimer(acrobiosystems， spn-c52h8)(ka为结合速率，kd为解离速率，kd为结合解离平衡常数)。
[0332]
如表9-11所示，抗体2f8、2f8-vl-vhh18、2f8-vh-vhh18和vhh18-fc与spikes1 rbd及其突变体的结合力良好。
[0333]
表9抗体与spike s1 rbd(acrobiosystems，spd-c52h3)的亲和力常数
[0334]
抗体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)2f84.7e+071.23e-032.61e-112f8-vl-vhh182.37e+075.39e-042.27e-11vhh18-fc8.17e+044.14e-045.07e-11
[0335]
表10抗体与三聚体spike trimer(acrobiosystems，spn-c52h8)的亲和力常数
[0336]
抗体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)2f84.44e+072.45e-065.51e-142f8-vl-vhh181.36e+066.41e-074.78e-13
vhh18-fc4.78e+053.75e-047.85e-10
[0337]
表11抗体2f8-vh-vhh18与抗原结合的亲和力常数(na表示非突变型，wt rbd monomer即spike s1 rbd)
[0338][0339][0340]
实施例5抗体的结合活性的检测
[0341]
1)将spike rbd蛋白(acrobiosytems，spd-c52h3)，p.1.突变株s1蛋白(义翘神州，40591-v08h14)，b.1.351突变株s1蛋白(义翘神州，40591-v08h15)， b.1.617突变株(义翘神州，40592-v08h88)，b.1.1.7突变株(义翘神州，40591-v08h8)， d614g突变株(近岸生物，dra57)，omicron ba.1 rbd，omicron ba.2rbd稀释至2μg/ml，每孔100μl置于96孔板(corning，9018)中，4℃包被过夜；将96孔板在清洗缓冲液pbst(含0.05％tween-20的pbs缓冲液)中清洗3次，之后加入封闭溶液(每孔200μl 3mg/ml bsa，溶剂为清洗缓冲液)，37℃孵育2h；然后，将96 孔板用清洗缓冲液洗涤3次，每孔添加梯度稀释的抗体溶液100μl，37℃孵
育1.5h 后；将96孔板用清洗缓冲液洗涤5次，加入100μl的抗人κ轻链抗体-过氧化物酶偶联物(在封闭溶液中稀释至1:2000)，37℃孵育1h；将96孔板用清洗缓冲液洗涤8 次，再添加100μltmb(tetramethylbenzidine，biopanda tmb-s-001)底物进行显；显10-15min后，加入50μl 0.1m h2so4终止反应，450nm的吸光度下测量96孔板的光吸收值。
[0342]
如表12所示，抗体vhh18-fc和2f8-vh-vhh18能结合spike rbd蛋白及突变株蛋白；结果显示，抗体2f8-vh-vhh18与spike rbd结合的ec
50
值约为10ng/ml。
[0343]
表12抗体的结合活性ec
50
(ng/ml)
[0344][0345]
注：
“‑”
表示未检测。
[0346]
2)采用上述方法检测抗体2f8-vh-vhh18与spike rbd或其变体的结合活性，结果如表13所示：抗体2f8-vh-vhh18能结合spike rbd蛋白及多种突变株蛋白。
[0347]
表13抗体的结合活性ec
50
(pm)
[0348]
[0349]
实施例6双特异抗体和重链抗体抑制假病毒侵染ace2
+
293细胞
[0350]
1)本实验是从体外评估抗体抑制spike-pseudotyped假病毒(吉满生物)侵染表达 ace2细胞(即ace2
+
293细胞)的能力。采用ace2
+
293细胞检测抗体抑制带有荧光素酶基因的sars-cov-2假病毒侵染细胞的能力。其主要原理是：采用ace2
+
293f 细胞作为易感染细胞，将不同浓度的抗体与sars-cov-2-fluc假病毒系统孵育；当抗体与假病毒孵育结合后，将阻断病毒侵染进入ace2
+
293细胞；假病毒无法有效侵染细胞，其基因组上的luciferase报告基因便无法在细胞内表达且产生荧光信号；由于荧光信号的信号值与加入的抗体浓度成负相关，从而可以检测抗体的体外抑制病毒侵染的能力。其中，野生型假病毒株wt的货号为gm-0220pv07(吉满生物)，突变株1 (e484k)的货号为gm-0220pv35(吉满生物)，突变株2(w436r)的货号为 gm-0220pv26(吉满生物)，突变株3(b.1.1.7/vui-202012/01 del 145y)的 gm-0220pv33(吉满生物)，突变株4(b.1.1.7/vui-202012/01 del 144y/145y)的货号为gm-0220pv34(吉满生物)，突变株5(b.1.351/501y.v2,beta)的货号为 gm-0220pv32-96t(吉满生物)，突变株6(d614g)的货号为gm-0220pv14(吉满生物)，突变株7(d614g,d936y)(gm-0220pv19,吉满生物)，突变株8(d839y) (gm-0220pv6,吉满生物)，突变株9(v483a)(gm-0220pv17,吉满生物)，突变株10(d614g,a831v)(gm-0220pv24,吉满生物)，突变株11(w436r)(gm-0220pv26,吉满生物)，突变株12(e484k+k417n+n501y)(gm-0220pv31,吉满生物)，突变株13 sars-cov-2spike(b.1.1.529,omicron)(gm-0220pv84，吉满生物)，突变株 14(k417n)(gm-0220pv30,吉满生物)，突变株15(n501y,d614g)(gm-0220pv29,吉满生物)，突变株16(n354d,d364y)(gm-0220pv13,吉满生物)。
[0351]
假病毒抑制能力检测方法为：抗体稀释至4μg/ml，后4倍梯度稀释，按照每孔50 μl体积转移至96孔检测板中，待用；将不同突变株的假病毒原液分别用含有10％fbs 的dmem培养基进行稀释，将稀释后的假病毒溶液按照25μl每孔转移至上述含有抗体的96孔板中，混匀后室温静置1h；将ace2
+
293细胞用0.25％trypsin-edta(gibco， 25200-072)消化后计数，将细胞密度调至4
×
105cells/ml，按照每孔50μl体积将细胞加入到上述96孔检测板中，37℃培养箱培养48h；每孔加入50μl bio-lite luciferaseassay system(诺维赞，dd1201-03)检测试剂，静置3分钟后进行读数，并根据读数计算抑制率：抑制率＝[1-(样品组-空白对照组)/(阴性对照组组-空白对照组)]
×
100％；其中，阴性对照组添加假病毒溶液且不添加抗体，空白对照组不添加假病毒溶液。
[0352]
ace2
+
293细胞的构建方法为：将hek293细胞(acs-4500tm，atcc)用含10％ fbs的dmem完全培养基培养，采用lipofectamine 2000transfection reagent(thermofisher，11668019)进行ace2表达质粒(义翘神州，hg10108-m)的转染，之后通过潮霉素(200μg/ml)的加压筛选和流式分选(采用10μg/ml anti-ace2和pe偶联的 anti-human igg-fc)，细胞继续扩增挑选出pe阳性率》90％的单克隆进行下一步扩增，筛选出表达ace2的hek293细胞，即ace2
+
293细胞。
[0353]
结果显示，抗体vhh18-fc对突变株2的ic
50
为327.4ng/ml；如表14所示， 2f8-vh-vhh18和2f8-vl-vhh18可有效地抑制假病毒侵染细胞。
[0354]
表14抗体对假病毒的ic
50
(ng/ml)
[0355][0356]
2)采用上述方法检测抗体2f8-vh-vhh18抑制假病毒的侵染活性，结果如表15 所示：2f8-vh-vhh18可有效地抑制多种假病毒侵染细胞。
[0357]
表15抗体对假病毒的ic
50
(pm)
[0358][0359][0360]
实施例7抗体抑制真病毒
[0361]
在bsl-3实验室将测抗体进行梯度稀释(初始浓度为60nm，3倍梯度稀释)，将抗体稀释液与200 pfu sars-cov-2野生型新冠病毒粒子(病毒株编号： 2019-ncov/iqtc01/human/2020/guangzhou，genbank为mt123290.1)或sars-cov-2delta(来源于广东省疾病预防控制中心)等体积混合，同时设立无抗体的病毒对照组和无病毒的细胞对照组；每实验组设置3个复孔，37℃静置1h；吸弃96孔板中的非洲绿猴肾细胞系vero e6细胞(atcc crl-1587)的上清液，取50μl孵育后的病毒抗体混合物转移至vero e6细胞板中，放置于细胞培养箱中37℃，孵育1小时；吸弃veroe6细胞板中上清液，加入100μl 37℃预热的dmem培养基(含1.6％cmc(羧甲基纤维素))，放置于37℃细胞培养箱培养24h；24h后取出细胞板，加入200μl的4％ pfa(多聚甲醛溶液)，4℃过夜孵育固定灭活病毒及细胞；第二天，吸弃上清后更换新鲜4％pfa，将96孔细胞板带入bsl-2实验室进行后续实验；使用frnt50 (plaque/focus reduction neutralization test(p/frnt))实验进行检测：破膜、封闭后分别使用
sars-cov-2n rabbitpolyclonal antibody(北京义翘神州，货号为40143-t62) 和hrp goat-anti rabbit igg(jackson，货号为111-035-003)作为一抗和二抗，依次进行孵育；洗涤干净后使用true blue进行显；immuno elisapot上机读取结果， graphpad软件进行数据分析。
[0362]
结果显示，抗体vhh18-fc、2f8-vh-vhh18和2f8-vl-vhh18可有效地抑制 sars-cov-2野生型真病毒侵染细胞：抗体vhh18-fc对应的ic
50
值为23.63nm，抗体2f8-vh-vhh18对应的ic
50
值为0.03nm，抗体2f8-vl-vhh18对应的ic
50
值为0.033 nm；抗体2f8-vh-vhh18可有效地抑制sars-cov-2delta真病毒侵染细胞，抗体2f8-vh-vhh18对应的ic
50
值为0.09nm。
[0363]
实施例8小鼠体内阻断真病毒药效试验
[0364]
在bsl-3实验室使用转染hace2(adenovirus(ad5-hace2))的balb/c雌性小鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司)进行病毒侵染试验，分为5组，每组12只；g1组：小鼠滴鼻感染105个新冠病毒(病毒株编号：2019-ncov/iqtc01/human/2020/guangzhou，genbank为mt123290.1)后给药pbs作为对照；g2组：小鼠腹腔注射1mg抗体2f8-vh-vhh18，24小时(h)后进行滴鼻105个感染新冠病毒；g3组：小鼠滴鼻感染105个新冠病毒，18小时后进行腹腔注射1mg抗体2f8-vh-vhh18；g4组：小鼠滴鼻给予1mg抗体2f8-vh-vhh18，24小时后进行滴鼻感染105个新冠病毒。在感染新冠病毒后第3天，每组取4只小鼠的肺组织进行匀浆，frnt方法检测小鼠肺部活病毒滴度。每组小鼠在感染病毒和注射抗体后每天进行体重检测，共检测14天。
[0365]
1)如图3所示，g2组、g3组和g4组均能阻断新冠病毒侵染肺组织。
[0366]
2)如图4所示，g2组和g4组小鼠的体重均未发生明显波动，g3组小鼠的体重在前4天发生明显下降，后恢复至正常水平。
[0367]
实施例9抗体对sars-cov-2的中和效果
[0368]
利用微量稀释中和法测定2f8-vh-vhh18对sars-cov-2野生株、alpha、beta、 gamma、delta和omicron突变株的中和水平。
[0369]
实验结果显示，2f8-vh-vhh18对所检测的sars-cov-2野生株、alpha、beta、 gamma、delta和omicron突变株共6种病毒株均有显著的中和效价。

技术特征：

1.靶向冠状病毒的双特异抗体，其包含结合spike蛋白的第一结合部分以及结合spike蛋白的第二结合部分，其中所述第一结合部分包含如seq id no:1或2所示的hcdr1、如seq id no:3或4所示的hcdr2、如seq id no:5-42中任一项所示的hcdr3、如seq id no:43或44所示的lcdr1、如seq id no:45或46所示的lcdr2和如seq id no:47或48所示的lcdr3中的一个或多个；所述第一结合部分的c-末端或n-末端通过连接子l1与所述第二结合部分进行连接。2.如权利要求1所述的双特异抗体，所述连接子l1为包含甘氨酸和丝氨酸的多肽；或者，所述连接子l1的序列为(g
m
s)
n
，其中每个m独立为2、3、4或5，n独立为1、2、3、4或5；或者，所述连接子l1的序列为(ggggs)
n
，所述n独立为1、2、3、4或5。3.如权利要求1或2所述的双特异抗体，所述第一结合部分包含如seq id no:1或2所示的hcdr1、如seq id no:3或4所示的hcdr2、如seq id no:5-42中任一项所示的hcdr3、如seq id no:43或44所示的lcdr1、如seq id no:45或46所示的lcdr2和如seq id no:47或48所示的lcdr3。4.如权利要求1-3任一项所述的双特异抗体，所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:6所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:9所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:15所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:16所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:18所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:19所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:20所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:21所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:22所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和
如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:23所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:24所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:25所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:28所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:29所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:30所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:32所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:33所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:34所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:35所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:36所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:37所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:39所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和
如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:40所示的hcdr3、如seq id no:43所示的lcdr1、如seq id no:45所示的lcdr2和如seq id no:47所示的lcdr3；或所述第一结合部分包含如seq id no:2所示的hcdr1、如seq id no:4所示的hcdr2、如seq id no:42所示的hcdr3、如seq id no:44所示的lcdr1、如seq id no:46所示的lcdr2和如seq id no:48所示的lcdr3。5.如权利要求1-4任一项所述的双特异抗体，所述第一结合部分包含重链可变区和轻链可变区；或者，所述第一结合部分的重链可变区包含重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4；所述重链fr1包含seq id no:49或50所示的序列，或与seq id no:49或50所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:49或50所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述重链fr2包含seq id no:51或52所示的序列，或与seq id no:51或52所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:51或52所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述重链fr3包含seq id no:53或54所示的序列，或与seq id no:53或54所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:53或54所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述重链fr4包含seq id no:55所示的序列，或与seq id no:55所示序列具有至少90％同一性的序列，或与seq id no:55所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。6.如权利要求5所述的双特异抗体，所述第一结合部分的重链可变区包含如seq id no:49或50所示的重链fr1、如seq id no:51或52所示的重链fr2、如seq id no:53或54所示的重链fr3和如seq id no:55所示的重链fr4；或者，所述第一结合部分的重链可变区包含如seq id no:49所示的重链fr1、如seq id no:51所示的重链fr2、如seq id no:53所示的重链fr3和如seq id no:55所示的重链fr4；或者，所述第一结合部分的重链可变区包含如seq id no:50所示的重链fr1、如seq id no:52所示的重链fr2、如seq id no:54所示的重链fr3和如seq id no:55所示的重链fr4。7.如权利要求5所述的双特异抗体，所述第一结合部分的重链可变区包含如seq id no:49所示的重链fr1、如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:51所示的重链fr2、如seq id no:3所示的hcdr2、如seq id no:53所示的重链fr3、如seq id no:5-41中任一项所示的hcdr3和如seq id no:55所示的重链fr4；或者，所述第一结合部分的重链可变区包含如seq id no:50所示的重链fr1、如seq id no:2所示的hcdr1、如seq id no:52所示的重链fr2、如seq id no:4所示的hcdr2、如seq id no:54所示的重链fr3、如seq id no:42所示的hcdr3和如seq id no:55所示的重链fr4。8.如权利要求1-7任一项所述的双特异抗体，所述第一结合部分的重链可变区包含seq id no:56或57所示的序列，或与seq id no:56或57所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:56或57所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述第一结合部分的轻链可变区包含seq id no:58或59所示的序列，或与seq id no:
58或59所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:58或59所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。9.如权利要求1-8任一项所述的双特异抗体，所述第二结合部分包含如seq id no:66所示的hcdr1、如seq id no:67所示的hcdr2和如seq id no:68所示的hcdr3中的一个、二个或三个；或者，所述第二结合部分包含如seq id no:66所示的hcdr1、如seq id no:67所示的hcdr2和如seq id no:68所示的hcdr3；或者，所述第二结合部分为单域抗体或重链抗体；或者，所述第二结合部分包含如seq id no:69或79所示的序列。10.如权利要求1-9任一项所述的双特异抗体，其特征在于，所述双特异抗体包含第一多肽和第二多肽；其中所述第一多肽包含如seq id no:72或77所示的序列，或与seq id no:72或77所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:72或77所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或所述第二多肽包含如seq id no:74或78所示的序列，或与seq id no:74或78所示序列具有至少80％同一性的序列，或与seq id no:74或78所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。11.一种抗体或抗原结合片段，其包含如seq id no:66所示的hcdr1、如seq id no:67所示的hcdr2和如seq id no:68所示的hcdr3中的一个、二个或三个；或者，所述抗体或抗原结合片段包含如seq id no:66所示的hcdr1、如seq id no:67所示的hcdr2和如seq id no:68所示的hcdr3；或者，所述抗体或抗原结合片段为单域抗体或重链抗体；或者，所述抗体或抗原结合片段包含如seq id no:69或79所示的序列。12.一种编码权利要求1-10任一项所述的双特异抗体或权利要求11所述的抗体或抗原结合片段的核酸。13.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-10任一项所述的双特异抗体或权利要求11所述的抗体或抗原结合片段。14.如权利要求1-10任一项所述的双特异抗体或权利要求11所述的抗体或抗原结合片段在制备或预防疾病的药物的用途。

技术总结

本发明提供结合SARS-CoV-2或SARS-CoV的spike蛋白的双特异抗体、单域抗体、重链抗体及其应用。其应用。其应用。

技术研发人员：

黄贤明 张慧 苏紫琪 苏华飞 黄皓晖 汪志炜 陈俊有 郑丹丹 李嘉萍 朱圣花 李婵 梁世德 李胜峰

受保护的技术使用者：

百奥泰生物制药股份有限公司

技术研发日：

2022.06.02

技术公布日：

2022/12/5