(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011188635.0
(22)申请日 2020.10.30
(71)申请人 迈威（上海）生物科技股份有限公司
地址 201210 上海市浦东新区李冰路576号
（创想园）3号楼4楼
申请人 江苏迈威康新药研发有限公司
(72)发明人 梅菲 任杰 方鹏 季荣钰 陈坤
孙小伟 曹雨霞
(51)Int.Cl.
C07K 16/24(2006.01)
C07K 1/22(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本公开提供一种去除抗体聚集体和降解片
通过对重组阿达木单抗亲和层析过程中pH值、电
或PEG添加剂提高了抗体单体得率。在优选的实
施例中重组阿达木单抗单体得率可达90%，产物
中单体的纯度超过95%。
权利要求书1页 说明书16页序列表5页 附图12页CN 112010970 A 2020.12.01
C N 112010970
A
1.一种抗TNF -α单克隆抗体亲和层析方法，其特征在于在洗脱缓冲液中加入选自聚乙二醇（PEG ）和尿素的添加剂，所述添加剂以有效去除抗体聚集体和降解片段、提高单体得率的方式添加于洗脱缓冲液中；所述抗TNF -α单克隆抗体为IgG1抗体，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示重链可变区；并且，具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示轻链可变区。
2.如权利要求1所述的抗TNF -α单克隆抗体亲和层析方法，其特征在于所述洗脱缓冲液中的添加剂为PEG8000，其在洗脱缓冲液中的工作浓度以重量/体积百分比计为2-8%。
3.如权利要求1所述的抗TNF -α单克隆抗体亲和层析方法，其特征在于所述添加剂为尿素，其在洗脱缓冲液中的工作浓度为0.1-1M。
4.如权利要求1所述的抗TNF -α单克隆抗体亲和层析方法，其特征在于所述洗脱缓冲液选自由柠檬酸-Na 2HPO 4、Gly -HCl、Arg -HCl、NaAc -HAc组成的组，所述洗脱缓冲液的pH值为
3.6-
4.2。
5.如权利要求1所述的抗TNF -α单克隆抗体亲和层析方法，其特征在于亲和层析的填料选自Mabselect、Bestarose Diamond。
6.如权利要求1-5任一所述的抗TNF -α单克隆抗体亲和层析方法，包括：
（1）样品的准备：将含抗体的细胞培养液上清澄清制备样品；
（2）平衡：以2-3柱体积的平衡缓冲液平衡亲和层析柱；
（3）上样：将样品上样至亲和层析柱，上样量为20-40mg/mL；
（3）再平衡：上样完成后以2-3柱体积的再平衡缓冲液进行再平衡；
（4）洗脱：以含有聚乙二醇（PEG ）或尿素添加剂的洗脱缓冲液洗脱；
（5）回收：分段收集洗脱液、合并洗脱峰级分。
7.如权利要求1-5任一所述的抗TNF -α单克隆抗体亲和层析方法，其特征在于抗体单体得率>80%。
8.如权利要求1-5任一所述的抗TNF -α单克隆抗体亲和层析方法在提高抗体单体纯度、增加抗体单体得率、降低抗体聚体含量、和/或减少抗体降解产物中的应用。
9.添加剂在提高抗TNF -α单克隆抗体单体纯度、增加抗TNF -α单克隆抗体单体得率、降低抗TNF -α单克隆抗体聚体含量、和/或减少抗TNF -α单克隆抗体降解产物中的应用，其特征在于，将所述添加剂作为抗体亲和层析纯化方法中洗脱缓冲液的组分，所述添加剂选自聚乙二醇（PEG ）和尿素；其中，所述抗TNF -α单克隆抗体具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示重链可变区；并且，具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示轻链可变区。
权 利 要 求 书1/1页CN 112010970 A
一种去除重组表达抗体聚体和降解产物的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物制药领域，具体涉及一种基因工程菌重组表达抗体的分离纯化方法，更具体涉
及一种从含重组抗体的培养液中去除重组表达抗体聚体和降解产物、提高重组表达抗体单体的含量和纯度的方法。
背景技术
[0002]肿瘤坏死因子α(TNFα)是由许多细胞类型(包括单核细胞和巨噬细胞)产生的细胞因子，其原始鉴定是基于其诱导某些小鼠肿瘤坏死的能力(参见例如Old，L.(1985)Science 230：630-632)。随后，一个与恶病质相关的名称为恶病质素的因子表明是与TNFα相同的分子。据信TNFα参与介导休克(参见例如Beutler，B.和Cerami，A.(1988)Annu.Rev. Biochem. 57：505-518；Beutler，B.和Cerami，A.(1988)Annu.Rev. Immunol.7：625-655)。另外，据信TNFα参与各种各样的其它人类疾病和紊乱的病理生理学，包括脓毒症、感染、自身免疫疾病、移植物排斥和移植物抗宿主病(参见例如Moeller，A.等(1990)Cytokine2：162-169；US5231024B；EP260610B1；Vasilli，P.(1992)Annu.Rev.Immunol. 10：411-452；Tracey，K.J.和Cerami，A.(1994)Annu.Rev.Med.45：491-503)。
[0003]由于人TNFα(hTNFα)在各种各样的人体紊乱中的有害作用，已设计策略以抑制或抵消hTNFα的活性。特别是，已寻与hTNFα结合或中和hTNFα的抗体做为抑制hTNFα活性的手段。一些最早的这种抗体是由用hTNFα免疫的小鼠的淋巴细胞制备的杂交瘤分泌的小鼠单克隆抗体(mAbs)(参见例如Hahn T；等，(1985)Proc Natl Acad Sci USA82：3814-3818；Liang，C-M.等(1986)Biochem.Bi
ophys.Res. Commun. 137：847-854；Hirai，M.等(1987)J.Immunol.Methods 96：57- 62；Fendly，B.M.等(1987)Hybridoma6：359-370；Moeller，A.等(1990) Cytokine2：162-169；US5231024B；EP186833B1；EP260610 B1号等)。为试图克服与在人体内使用全鼠抗体相关的问题，已对鼠抗hTNFα抗体进行遗传工程使其更“人类化”。例如，已制备嵌合抗体，其中抗体链的可变区为鼠源，而抗体链的恒定区为人源(Knight，D.M等 (1993)Mol.Immunol. 30：1443-1453等)。另外，也已制备人化抗体，其中所述抗体可变区的超变域为鼠源，但所述可变区的其余部分和所述抗体恒定区为人源(WO 92/11383A1)；英夫利昔单抗是一种抗人TNFα的人鼠嵌合IgG1单克隆抗体(由人源IgG1恒定区和小鼠可变区组成)。
[0004]优于鼠mAbs或其衍生物(例如嵌合抗体或人化抗体)的hTNFα抑制剂可以是完全人类抗hTNFα抗体，因为这种药剂甚至在长期给药时也不会引起该HAMA反应。已使用人类杂交瘤技术制备了抗hTNFα人单克隆自身抗体(Boyle，P.等(1993)Cell.Immunol. 152：556-568；B o y l e，P.等(1993)C e l l.I m m u n o l. 152：569-581)。阿达木单抗最初由CambridgeAntibody Technologies（CAT）和BASF子公司BASF Knoll合作开发。2002年，雅培制药公司（Abbott）以69亿美元收购BASFKnoll而获得阿达木单抗。阿达木单抗是重组人源IgG1单克隆抗体，含有人源轻链和重链可变区序列和人源IgG1，通过特异性结合人体内的TNFα，阻止TNFα与其细胞表面受体结合，从而阻断了TNFα的生物学活性，最终减轻炎症反应
并减少破骨细胞激活，达到控制并缓解症状体征的目的。阿达木单抗在成人中重度慢性类风湿性关节炎和儿童多关节少年特发性关节炎、银屑病和银屑病关节炎、强直性脊柱炎、儿童和成人克罗恩病、溃疡性结肠炎、结节病、葡萄膜炎等方面效果明显。[0005]在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等基因工程细胞株制备抗体时，抗体分子在重组表达、提取、纯化过程中容易被宿主蛋白酶降解产生无活性降解产物，并且重组抗体分子在宿主细胞中翻译后修饰、折叠、转运、分泌过程中易发生多聚化产生聚集体。降解产物、聚集体的存在不仅对重组抗体分子活性带来不期望的影响，而且由于其与抗体分子单体序列结构、理化参数等方面高度相似，仅在长度、状态等方面存在差异，采用常规的蛋白质纯化手段往往难以达到理想的纯化效果。聚乙二醇（PEG）在离子交换过程中可以通过提高样品在柱上的保留时间，从而实现聚体的有效分离(Milby et al., 1989, Gagnon et al., 1996, 2006)。Pete Gagnon在用羟基磷灰石进行抗体纯化过程中发现，PEG 4600可有效分离聚体（Pete Gagnon，2008）。
[0006]抗体药物生产过程中亲和纯化是非常关键的一个工艺步骤，该过程对发酵液中的抗体进行捕获浓缩，实现抗体粗纯化的第一步，通过对亲和纯化工艺进行优化提高抗体单体纯度、增加抗体单体得率、降低抗体聚体含量、减少抗体降解产物是抗体药物制备过程中急需解决的技术问题。
发明内容
[0007]为了解决亲和层析难以去除抗体聚体和降解片段的技术问题，本发明基于对现有技术中去除蛋白聚体方法的研究发现聚乙二醇（PEG）增加抗体蛋白保留时间、去除聚集体的功能主要取决于PEG改善了层析过程中固定相表面的水合能力，推测PEG改善基质水合能力的作用也可能适用于亲和基质，尝试在亲和层析中使用PEG提高亲和层析的分辨率、以期去除聚集体和降解片段。基于上述发现和分析，提供了一种去除抗体聚集体和降解片段、提高抗体单体得率和纯度的亲和层析方法。通过对重组阿达木单抗亲和纯化过程中pH值、电导率、缓冲液类型等参数条件的优化提高了抗体单体的纯度，进而通过在洗脱缓冲液中加入尿素或PEG添加剂提高了抗体单体得率。在优选的实施例中重组阿达木单抗单体得率可达90%，产物中单体的纯度超过95%。
[0008]具体而言：
一方面，本发明提供一种抗体亲和层析方法，其特征在于，在洗脱缓冲液中加入选自聚乙二醇（PEG）和尿素的添加剂，所述添加剂以有效去除抗体聚集体和降解片段、提高单体得率的方式添加于洗脱缓冲液中。
[0009]进一步，本发明所述的抗体亲和层析方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液中的添加剂为PEG8000，其在洗脱缓冲液中的工作浓度以重量/体积百分比计为2-8%，优选3-4%，更优选3.4%。
[0010]进一步，本发明所述的抗体亲和层析方法，其特征在于所述添加剂为尿素，其在洗脱缓冲液中
的工作浓度为0.1-1M，优选0.5M。
[0011]进一步，本发明所述的抗体亲和层析方法，其特征在于所述洗脱缓冲液选自由柠檬酸-Na2HPO4、Gly-HCl、Arg-HCl、NaAc-HAc组成的组，所述洗脱缓冲液的pH值为3.6-4.2，优选3.85-3.92，更优选3.9。
[0012]进一步，本发明所述的抗体亲和层析方法，其特征在于亲和层析的填料选自Mabselect、Bestarose Diamond。
[0013]进一步，本发明所述的抗体亲和层析方法，其特征在于所述抗体具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所述重链可变区；并且，具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所述轻链可变区。[0014]进一步，本发明前述任一所述的抗体亲和层析方法，包括：
（1）样品的准备：将含抗体的细胞培养液上清澄清制备样品；
（2）平衡：以2-3柱体积的平衡缓冲液平衡亲和层析柱；
（3）上样：将样品上样至亲和层析柱，上样量为20-40mg/mL；
（3）再平衡：上样完成后以2-3柱体积的再平衡缓冲液进行再平衡；
（4）洗脱：以含有聚乙二醇（PEG）或尿素添加剂的洗脱缓冲液洗脱；
（5）回收：分段收集洗脱液、合并洗脱峰级分。
[0015]进一步，本发明所述的抗体亲和层析方法，其特征在于，亲和层析纯化产物中抗体单体得率>80%、抗体单体纯度>85%；优选抗体单体得率>85%、单体纯度>95%。
[0016]第二方面，本发明还提供前述第一方面任一所述的抗体亲和层析方法在提高抗体单体纯度的应用。
[0017]本发明还提供前述第一方面任一所述的抗体亲和层析方法在增加抗体单体得率的应用。
[0018]其中，所述单体得率是指洗脱样品总蛋白中单体含量与起始样品中单体含量的百分比。
[0019]本发明还提供前述第一方面任一所述的抗体亲和层析方法在降低抗体聚体含量的应用。
[0020]本发明还提供前述第一方面任一所述的抗体亲和层析方法在减少抗体降解产物中的应用。
[0021]第三方面，本发明提供添加剂在提高抗体单体纯度、增加抗体单体得率、降低抗体聚体含量、和/或减少抗体降解产物中的应用，其特征在于，将所述添加剂作为抗体亲和层析纯化方法中洗脱缓冲液的组分，所述添加剂选自聚乙二醇（PEG）和尿素，优选所述添加剂为PEG8000。
[0022]进一步，本发明所述的应用，其特征在于，所述洗脱缓冲液中的添加剂为PEG8000，其在洗脱缓冲液中的工作浓度以重量/体积百分比计为2-8%，优选3-4%，更优选3.4%。[0023]进一步，本发明所述的应用，其特征在于所述添加剂为尿素，其在洗脱缓冲液中的工作浓度为0.1-1M，优选0.5M。
[0024]进一步，本发明所述的应用，其特征在于所述洗脱缓冲液选自由柠檬酸-Na2HPO4、Gly-HCl、Arg-HCl、NaAc-HAc组成的组，所述洗脱缓冲液的pH值为3.6-4.2，优选3.85-3.92，更优选3.9。
[0025]进一步，本发明所述的应用，其特征在于亲和层析的填料选自Ma bselect、Bestarose Diamond。
[0026]进一步，本发明所述的应用，其特征在于所述抗体具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3所述重链可变区；并且，具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所述轻链可变区。
[0027]除非另有说明，本文所用的术语和短语具有下文所列的含义。特定的术语或短语
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