(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.06.11
C N 103849666
A (21)申请号 201310167034.5
(22)申请日 2013.05.08
C12P 19/30(2006.01)
C12N 9/12(2006.01)
C12N 11/12(2006.01)
C12N 11/10(2006.01)
C12N 11/08(2006.01)
C12R 1/19(2006.01)
(71)申请人开平牵牛生化制药有限公司
地址529339 广东省江门市开平市沙塘镇表
海工业区新科路一号
(72)发明人刘桂祯 黄炯威 周华润 莫世艺
劳瑞雄
(74)专利代理机构广州市红荔专利代理有限公
司 44214
代理人李彦孚
吴伟文
(54)发明名称
(57)摘要
一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，
包括如下步骤：利用分子克隆胞苷磷酸转移酶基
因的大肠杆菌工程菌发酵制备胞苷磷酸转移酶，
并提纯制备胞苷磷酸转移酶液；胞苷磷酸转移酶
的固定化；以磷酸胆碱及三磷酸胞苷二钠为原
料，由固定化胞苷磷酸转移酶催化生成胞磷胆碱。
本发明生产工艺简单，生产周期短，生产成本低，
能广泛应用于胞磷胆碱的产业化生产。
(51)Int.Cl.
权利要求书2页 说明书6页 附图9页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书6页 附图9页(10)申请公布号CN 103849666 A
1.一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，包括如下步骤：
（1）、工程菌发酵：
把分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液接种到培养基体系中培养26～32小时，所述分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液的加入体积为培养基体系体积的5%～10%；期间补充适量葡萄糖、蛋白胨和酵母提取物，发酵完成后发酵液离心收集菌体；
（2）、制备胞苷磷酸转移酶清液：
取上述菌体悬浮在磷酸缓冲液中用超声波或匀浆仪破碎，获得破碎液，在上述破碎液中加入硫酸铵进行盐析，获得饱和度为25%～45%盐析液，再用孔径为100～500nm的陶瓷膜过滤器将上述盐析液固液分离，得胞苷磷酸转移酶清液，其中，所述菌体与所述磷酸缓冲液的悬浮比例为1：4～1：10；
（3）、胞苷磷酸转移酶清液的固定化：
上述胞苷磷酸转移酶清液中加入固定化载体，搅拌固化，获得固定化胞苷磷酸转移酶，所述固定化载体的加入量与胞苷磷酸转移酶清液的比例为100～200克/L；
将含三磷酸胞苷二钠30～80mmol/L、磷酸胆碱60～400mmol/L以及乙酸镁10～50mmol/L的水溶液混合配制成合成反应液，调节合成反应液的pH值至6.0～9.0，加入所述固定化胞苷磷酸转移酶，并在10～50℃的水浴温度下搅拌反应4～10小时，过滤后得到的清液即为胞磷胆碱钠液，所述固定化胞苷磷酸转移酶的加入量与合成反应液的比例为10～50g/L； （5）、提取纯化：
将上述胞磷胆碱钠液经层析分离结晶干燥，得到胞磷胆碱钠的干品。
2.根据权利要求1所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述培养基体系中含有蛋白胨10～20g/L，酵母提取物10～20g/L，葡萄糖5～8g/L，无机盐8～15g/L，余量为纯化水。
3.根据权利要求2所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，工程菌发酵发酵过程中，期间补充的葡萄糖的量为培养基体系中含有的葡萄糖的量的10-15倍，补充的蛋白胨的量为为培养基体系中含有的蛋白胨的量的50-80%，补充的酵母提取物的量为为培养基体系中含有的酵母提取物的量的50-80%。
4.根据权利要求3所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述固定化载体选自纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、多聚氨基酸、聚苯乙烯、尼龙或多孔玻璃载体的任一种。
5.根据权利要求4所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述固定化载体中含有芳香氨基或羟基或羧基或羧甲基或环氧基或氨基功能基团中的至少一个基团。
6.根据权利要求5所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，胞磷胆碱钠的合成的步骤中，固定化胞苷磷酸转移酶10～50g/L，三磷酸胞苷二钠为30～80mmol/L；磷酸胆碱60～400mmol/L；乙酸镁10～50mmol/L；反应温度25～40℃；pH值为6.0～9.0。
7.根据权利要求6所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，胞磷胆碱钠的合成的步骤中，固定化胞苷磷酸转移酶含量为20～30g/L，三磷酸胞苷二钠为40～60mmol/L；磷酸胆碱120～240mmol/L；乙酸镁20～30mmol/L；反应温度30～40℃；pH 值为6.5～8.0。
一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法
技术领域：
[0001] 本发明涉及制药领域，具体是指一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法。
背景技术：
[0002] 胞磷胆碱钠又称胞二磷胆碱钠，化学名胆碱胞嘧啶核苷二磷酸酯的单钠盐，一种脑代谢激活剂，为核苷衍生物，是磷酯酰胆碱的前体物质，是卵磷脂合成所必需的辅酶，于1954年发现，1956年合成，1973年国内试制成功。
[0003] 胞磷胆碱钠的药理作用主要有：可恢复脑细胞损伤后细胞膜的结构，增强细胞膜的功能，改善神经元的功能；降低脑血管阻力，增加脑血流量，促进脑代谢，改善脑循环，提高脑功能；增加包括乙酰胆碱和多巴胺在内的神经传导介质的分泌，增强与意识有关的脑干网状结构功能，改善头部外伤后或脑手术后意识障碍的意识状态及脑电图，促进脑卒中偏瘫病人的上肢运动功能的恢复，对促进大
脑功能恢复、促进苏醒有一定作用；促进卵磷脂生物合成和抗磷脂酶A作用，从而加速脑水肿的重吸收。增进多巴胺能活动，调控锥体外系的生理功能。与蛋白分解酶抑制剂合用，可保护及修复胰腺组织。
[0004] 临床上胞磷胆碱钠主要用于急性颅脑外伤和脑手术后意识障碍，帕金森氏综合症(Parkinson’s disease)；神经性耳聋；对老年性痴呆症(Alzheimer’s disease )、抑郁症、延缓衰老，提高学习效果和记忆力等有一定的疗效。
[0005] 胞磷胆碱钠的生产方法包括化学合成法，微生物发酵法及酶促合成法三种方法。化学合成法，以胞苷酸（CMP）、磷酸胆碱（CP）为底物, 用对甲苯磺酰氯为缩合剂，在N-二甲基甲酰胺(DMF)存在下缩合成胞磷胆碱钠，化学合成存在反应转化率低，副产物多，生产成本高，环境污染严重等问题；微生物发酵法是用酵母菌或产氨短杆菌等微生物利用葡萄糖，并添加CMP、CP等前提物发酵生成胞磷胆碱钠，微生物发酵法存在产物浓度低，产率不稳定等问题；酶促合成法曾有以豚鼠肝细胞匀浆提抽胞苷磷酸转移酶，并催化CTP与磷酸胆碱生成胞磷胆碱钠的初步报道，但因酶的来源问题，酶促合成法无法实现。
发明内容：
[0006] 本发明的目的是提供一种旨在解决化学合成法，微生物发酵法及酶促合成法生产胞磷胆碱钠的
种种缺陷，生产工艺简单，生产周期短，生产成本低，能广泛应用于胞磷胆碱钠的产业化生产的酶催化合成胞磷胆碱钠的方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，包括如下步骤：
[0009] （1）、工程菌发酵：
[0010] 把分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液接种到培养基体系中培养26～32小时，所述分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液的加入体积为培养基体系体积的5%～10%；期间补充适量的葡萄糖、蛋白胨以及酵母提取物，发酵完成后发酵液离心收集菌体。
[0011] （2）、制备胞苷磷酸转移酶清液：
[0012] 取上述菌体悬浮在磷酸缓冲液中用超声波或匀浆仪破碎，获得破碎液，在上述破碎液中加入硫酸铵进行盐析，获得饱和度为25%～45%盐析液，再用孔径为100～500nm的陶瓷膜过滤器将上述盐析液固液分离，得胞苷磷酸转移酶清液，其中，所述菌体与所述磷酸缓冲液的悬浮比例为1：4～1：10。
[0013] （3）、胞苷磷酸转移酶清液的固定化：
[0014] 上述胞苷磷酸转移酶清液中加入固定化载体，搅拌固化，获得固定化胞苷磷酸转移酶，所述固定化载体的加入量与胞苷磷酸转移酶清液的比例为100～200克/L。[0015] （4）、胞磷胆碱钠的合成：
[0016] 将含三磷酸胞苷二钠30～80mmol/L、磷酸胆碱60～400mmol/L以及乙酸镁10～50mmol/L的水溶液混合配制成合成反应液，调节合成反应液的pH值至6.0～9.0，加入固定化胞苷磷酸转移酶，并在10～50℃的水浴温度下搅拌反应4～10小时，过滤后得到的清液即为胞磷胆碱钠液，所述固定化胞苷磷酸转移酶的加入量与合成反应液的比例为10～50g/L。
[0017] （5）、提取纯化
[0018] 将上述胞磷胆碱钠液经层析分离结晶干燥，得到胞磷胆碱钠的干品。
[0019] 其中，所述分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所保藏编号为CGMCC NO：4428。[0020] 进一步地，所述培养基体系中含有蛋白胨10～20g/L，酵母提取物10～20g/L，葡萄糖5～8g/L，无机盐8～15g/L，余量为纯化水，工程菌发酵发酵过程中，期间补充的葡萄糖的量为培养基体系中含有的葡萄糖的量的10-15倍，补充的蛋白胨的量为为培养基体系中含有的蛋白胨的量的50-80%，补充的酵母提取物的量为为培
养基体系中含有的酵母提取物的量的50-80%。
[0021] 进一步地，所述固定化载体选自纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、多聚氨基酸、聚苯乙烯、尼龙或多孔玻璃载体的任一种。
[0022] 进一步地，所述固定化载体中含有芳香氨基或羟基或羧基或羧甲基或环氧基或氨基功能基团中的至少一个基团。
[0023] 优选地，胞磷胆碱钠的合成的步骤中，固定化胞苷磷酸转移酶10～50g/L，三磷酸胞苷二钠为30～80mmol/L；磷酸胆碱60～400mmol/L；乙酸镁10～50mmol/L；反应温度25～40℃；pH值为6.0～9.0。
[0024] 优选地，胞磷胆碱钠的合成的步骤中，固定化胞苷磷酸转移酶含量为20～30g/L，三磷酸胞苷二钠为40～60mmol/L；磷酸胆碱120～240mmol/L；乙酸镁20～30mmol/L；反应温度30～40℃；pH 值为6.5～8.0。
[0025] 本发明的主要技术优越特性如下：
[0026] 1.采用分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌高密度发酵制备胞苷磷酸转移酶，酶源稳定，避免目前国内普遍采用的啤酒酵母反应体系所带来的车间环境污染及大量废酵母渣需处理等
缺点。
[0027] 2.采用固定化胞苷磷酸转移酶催化合成反应，可反复多次使用，反应条件温和容
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