(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710884647.9
(22)申请日 2017.09.26
(71)申请人 上海蕙禾生物科技事务所
地址 201100 上海市崇明区横沙乡富民支
路58号D1-9062室(上海横泰经济开发
区)
(72)发明人 徐荻
(74)专利代理机构 上海华工专利事务所(普通
合伙) 31104
代理人 缪利明
(51)Int.Cl.
A61K 8/98(2006.01)
A61K 8/64(2006.01)
A61K 8/67(2006.01)
A61K 8/73(2006.01)
A61K 8/92(2006.01)A61Q 19/08(2006.01)A61Q 19/00(2006.01)
(54)发明名称一种白细胞提取物及其制备方法与应用(57)摘要本发明公开了一种白细胞提取物的制备方法，直接以新生儿脐带血为原料，经人淋巴细胞分离液密度梯度离心得到PBMC细胞，并通过脐带血中分离的脐带血浆扩增培养，然后离心分离得到上清液，超滤后得到白细胞提取物。该方法无需牛血清，不含异种动物蛋白，不含刺激因子，对人体应用的安全性好。本发明的方法制备的白细胞提取物，含有丰富的天然人细胞因子，其中bFGF达到60pg/ml以上，且产率高，生产成本低。本发明还提供上述白细胞提取物在活化、修复细胞功效的化妆品中的应用。上述白细胞提取物添加至化妆品中，可与化妆品配方中的其它组分发挥协同作用，协同提高细胞线粒体功能，提供细胞代谢的全面营养素，显著提高白细胞提取物的 活化细胞功能。权利要求书2页 说明书11页 附图3页CN 108567719 A 2018.09.25
C N 108567719
A
1.一种白细胞提取物的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
(1)、新生儿脐带血经人淋巴细胞分离液密度梯度离心分离，得到上层的脐带血浆和下层的白膜层，所述脐带血浆经过灭活后，得到灭活的脐带血浆，备用；
(2)、从所述白膜层分离出PBMC细胞，接种到无血清培养基，然后添加所述灭活的脐带血浆对PBMC细胞进行扩增，最后离心分离，收集上清液；
(3)、步骤(2)的上清液经超滤，收集截留液，即为白细胞提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述的添加所述灭活的脐带血浆对PBMC细胞进行扩增的步骤还包括如下分步骤：
1)、预扩增步骤：添加适量的IL-2和PBMC细胞的体积分数为5～10％的所述灭活的脐带血浆，在37℃、5％CO2条件下培养，一周后离心，弃上清液，保留诱导扩增的淋巴细胞；
2)、扩增步骤：将步骤1)分离得到的淋巴细胞接种到RPMI 1640培养基，并添加体积分数为5～10％的所述灭活的脐带血浆进行培养，定期收集细胞培养上清液，在细胞衰老前离心细胞，收集全部上清液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的超滤步骤中，采用1KD超滤膜进行超滤。
4.一种权利要求1-3中任一项所述的制备方法制备的白细胞提取物。
5.根据权利要求4所述的白细胞提取物，其特征在于，所述白细胞提取物中，含有50～90pg/ml的碱性成纤维细胞生长因子。
6.一种权利要求4或5所述的白细胞提取物在制备具有活化、修复细胞功效的化妆品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，用于制备抗皱修复精华液或抗皱精华乳。
8.一种含有权利要求4或5所述的白细胞提取物的抗皱修复精华液，其特征在于，由下列组分制备而成：
A组分：丁二醇1～10g，紫草提取物1～2g，甘草根提取物1～2g，乳酸杆菌大豆发酵产物滤液1～2g，白头翁提取物0.5～2g，烟酰胺0.5～2g，1,2-已二醇0.2～0.5g，辛甘醇0.1～0.5g，D-泛醇0.2～1g，透明质酸0.1～1g，薰衣草花水1～10g；
B组分：白细胞提取物冻干粉400～1000mg；
加水至100ml；
所述白细胞提取物冻干粉每200mg由2ml所述的白细胞提取物制备而成。
9.一种含有权利要求4或5所述的白细胞提取物的抗皱精华乳，其特征在于，由下列组分制备而成：
油相：3.5～15.5g；
乳化剂：0.5～2g；
活性组分一：丁二醇1～10g，紫草提取物1～2g，甘草根提取物1～2g，乳酸杆菌大豆发酵产物滤液1～2g，白头翁提取物0.5～2g，烟酰胺0.5～2g，1,2-已二醇0.2～0.5g，辛甘醇0.1～0.5g，D-泛醇0.2～1g，透明质酸0.1～1g，加水至78～90ml；
活性组分二：白细胞提取物冻干粉400～1000mg；
所述白细胞提取物冻干粉每200mg由2ml所述的白细胞提取物制备而成。
10.根据权利要求9所述的抗皱精华乳，其特征在于，所述油相为：甜杏仁油1.5～7.5g，
霍霍巴油1.5～7.5g，植物精油0.2～1g；所述乳化剂为：山梨醇橄榄油酸酯0.2～1g，鲸蜡硬酯基葡萄糖苷0.3～1g。
一种白细胞提取物及其制备方法与应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种白细胞提取物及其制备方法与应用。
背景技术
[0002]白细胞是血液中除红细胞和血小板以外的血细胞的统称，包含五大类：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。它们主要参与机体的防御和免疫功能。其中中性粒细胞占白细胞的50％-70％，具有活跃的变形运动和吞噬能力，能吞噬细菌。嗜酸性粒细胞能减弱过敏反应，还能杀灭寄生虫。嗜碱性粒细胞可能导致过敏反应。单核细胞离开血管后进入血管周围的结缔组织成为巨噬细胞，能消灭入侵的病原微生物，吞噬异物颗粒和衰老的细胞，还参与调节免疫反应。淋巴细胞占白细胞总数的20-30％，包括B 淋巴细胞，T淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK)三种，淋巴细胞对调节机体细胞生长分化、调节免疫功能、参与炎症发生和创伤愈合以及协调机体免疫防御体系，维持机体内环境稳定发挥重要作用。
[0003]淋巴细胞的调节功能主要靠其释放的细胞因子来发挥，细胞因子除了对自身细胞可发挥调节作用外，还对邻近的细胞以及远处的细胞发挥旁分泌和内分泌调节作用，从而发挥调节机体固有免疫和适应性免疫的平衡、促进血细胞生成和组织细胞生长以及促进损伤组织修复等多种功能。
[0004]天然状态人淋巴细胞可分泌多种细胞因子，包括具有调节特定细胞生长和代谢功能的生长因子类(growth factor,GF)、白细胞介素(interleukin,IL)类、集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)类、干扰素(interferon,IFN)类及转化生长因子。[0005]生长因子类如表皮细胞生长因子(EGF)、酸性和碱性成纤维细胞生长因子(aFGF、bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子(LIF)、神经生长因子(NGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等，可以定向促进各种细胞的生长，促进细胞间基质的形成，促进损伤组织的修复(Adv Skin Wound Care.2012Aug；25(8):349–370.)，在细胞间相互作用、免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节作用。其中，转化生长因子，这一家族除转化因子TGF-β外，还有活化素(activins)和骨形成蛋白(bone morpho-geneticproteins,BMPs)等，对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用，可促进成纤维细胞等组织细胞的生长，促进细胞外基质如胶原蛋白、纤粘连蛋白的表达，对细胞的形态发生、增殖和分化过程起着重要作用(Prog Retin Eye Res.2015Nov；49:17–45.)。
[0006]白细胞介素(interleukin,IL)类，如IL1、IL2、IL6、IL10等已报道的有三十余种(IL-1―IL-38)。在细胞之间发挥促进生长和分化，以及调节免疫反应，促进免疫应答防止组织损伤的作用(Crit Rev Immunol.2012；32(1):23–63.)。
[0007]集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)类，如G(粒细胞)-CSF、M(巨噬细胞)-CSF、GM(粒细胞、巨噬细胞)-CSF、Multi(多重)-CSF(IL-3)、SCF、EPO等。可刺激不同发育阶段的造血干
细胞和祖细胞增殖分化，还可促进成熟细胞的功能。
[0008]干扰素(interferon,IFN)类，如IFN-α、IFN-β和IFN-γ等十余种，可以激活淋巴细胞功能并发挥抗病毒和抗细菌感染以及抗肿瘤作用(F r o n t C e l l I n f e c t Microbiol.2014；4:50.)及免疫调节作用。
[0009]因此，细胞因子虽然在体内含量极微，但是其生物活性极高，为人体细胞发挥正常生理功能所必须。基于细胞因子的强大功效，开发利用细胞因子的研究正在大量进行，如：[0010]2013年美国哈佛大学的Loffredo等科学家使用老少配的连体共生动物实验，将老年小鼠和年轻小鼠的血液进行互相交换，四周后老年小鼠肥大的心脏恢复正常，从而验证年轻的血液中含有可以逆转衰老的因子，而且进一步研究证明一种属于细胞因子TGF-β家族的GDF11因子可以使骨骼肌干细胞恢复青春(Cell.2013May 9；153(4):828–839.。) [0011]2015年斯坦福大学Wyss-Coray教授团队发现在老年小鼠和年轻小鼠经手术缝合连体共生一周后两只小鼠的淋巴细胞发生了交换，虽然淋巴细胞不能进入异体小鼠大脑，但是细胞分泌的活性蛋白可以透过血脑屏障进入大脑，并改善老年小鼠的学习能力和睡眠(Sci Rep.2016；6:29015)。
[0012]因此，将白细胞提取物中的活性物质-细胞因子提取出来进行研究应用将具有十分重要的意义。
[0013]然而，现有的白细胞提取物的提取方法存在如下缺陷：
[0014](一)、目前白细胞提取物所用原料为成人外周血白细胞，经过裂解并去除杂质获得以核苷酸为主的产物，这个方法的细胞来源少、产率低，而且核苷酸作为机体细胞是可以通过吸收氨基酸等体内营养物质而自行合成的外源性产物。应用于化妆品时，外源性的补充对皮肤有何实质益处尚有争议。
[0015](二)、人外周血中的白细胞已经走向衰老，分泌活性细胞因子的能力开始下降，且扩增淋巴细胞时以牛血清作为培养添加剂也带来种种未知的风险。
[0016](三)、采用生物活性物质作为原料的化妆品存在活性物质不明确，活性不易保存等问题。
[0017]另外，现有的白细胞提取物应用于化妆品时，也存在如下技术缺陷：添加白细胞提取物的化妆品配方，仅以保存或发挥该白细胞提取物中的细胞因子的功能为目的。如何合理选择合适的化妆品组分，能够与细胞因子充分发挥协同作用，从而增强其活化细胞的功效还未见报道。
发明内容
[0018]本发明的第一个目的在于提供一种白细胞提取物的制备方法，对人体应用的安全性好，且产率高，生产成本低。
[0019]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0020]一种白细胞提取物的制备方法，包括如下制备步骤：
[0021](1)、新生儿脐带血经人淋巴细胞分离液密度梯度离心分离，得到上层的脐带血浆和下层的白膜层，所述脐带血浆经过灭活后，得到灭活的脐带血浆，备用；
[0022](2)、从所述白膜层分离出PBMC细胞，接种到无血清培养液，然后用所述灭活的脐带血浆对PBMC细胞进行扩增，最后离心分离，收集上清液；
[0023](3)、步骤(2)离心收集的上清液经超滤，收集截留液，即为白细胞提取物。
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