(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910445410.X
(22)申请日 2019.05.27
(71)申请人 创芯国际生物科技(广州)有限公司
地址 510000 广东省广州市黄埔区瑞发路1
号自编(1)栋四层016房
(72)发明人 郑鸿平 邱培 陈泽新
(74)专利代理机构 深圳市兴科达知识产权代理
有限公司 44260
代理人 许尤庆
(51)Int.Cl.
C12N 5/09(2010.01)
C12Q 1/02(2006.01)
A01N 1/02(2006.01)
(54)发明名称
测试方法
(57)摘要
养方法及药敏测试方法，本发明的培养基，可以
分型高度一致，组织形态也高度相似。除了满足
科学研究的需要，在临床用药指导方面，体外类
器官培养为患者的药物用药指导提供了很好的
一个有益的选择。权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 110129270 A 2019.08.16
C N 110129270
A
1.一种胸腹水类器官培养基，其特征在于，培养基的成分及其含量如下：B27，40-60X稀释；N -acetylysteine，1-5mM；EGF，1-100ng/ml；Noggin，50-200ng/ml；R -spondin1，200-1000ng/ml或10-50％(v/v)条件培养基；A83-01，200-1000nM；FGF10,50-200ng/ml；FGF2，10-50ng/ml；Nicotinamide，1-20mM；Y -27632，1-20μM；Prostaglandin E2，0.1-2μM；SB202190，1-20μM；Heparin，1-5μg/ml。
2.如权利要求1所述的胸腹水类器官培养基，其特征在于，培养基的成分及其含量如下：B27，50X稀释；N -acetylysteine，2.5mM；EGF，10ng/ml；Noggin，100ng/ml；R -spondin1，500ng/ml或30％(v/v)条件培养基；A83-01，500nM；FGF10 100ng/ml，FGF2，25ng/ml；Nicotinamide，10mM；Y -27632，10μM；Prostaglandin E2，1μM；SB202190，10μM；Heparin，2.5μg/ml。
3.如权利要求1或2所述的胸腹水类器官培养基，其特征在于，胸腹水为肿瘤患者术后的胸腔或腹腔积液。
4.一种癌性胸腹水类器官培养方法，其特征在于，具体步骤为：收取胸腹水，加入一定体积的保存液，摇床震荡，过滤细胞，离心，去除上清，加入DMEM/F12，离心，去除上清；细胞计数，加入胶液，滴于孔板孔正中，放置培养皿，凝固胶液；每孔加入权利要求1-3任一项的培养基，细胞培养箱培养。
5.如权利要求4所述的癌性胸腹水类器官培养方法，其特征在于，上述方法的步骤为：无菌环境收取肿瘤患者手术后胸腹水100ml，加入20ml保存液，转移至37℃、200rpm摇床震荡20min.用100μm细胞筛网过滤细胞，离心(4℃，200g，5min)，去除上清；加入10ml DMEM/F12重悬，离心(4℃，200g，5min)，去除上清；细胞计数，加入胶液(含20％的Matrigel和80％Ⅰ型胶原蛋白)，5000细胞每30μl，滴于48孔板孔正中，放置培养皿至37℃，5％CO 2中10min，凝固胶液；每孔加入150μl权利要求1-3任一项的培养基，37℃，5％CO 2，细胞培养箱培养；每间隔3-4天更换一次培养基。
6.如权利要求4或5所述的癌性胸腹水类器官培养方法，其特征在于，所述保存液，包括以下成份：B27，0.5x；Hepes，5mM；dispase Ⅱ，0.1％；EGF，10ng/ml；N2，0.5x；Nicotinamide，5mM；Y -27632，5μM；A83-01，0.5μM；SB202190，5μM中的一种或多种。
7.一种胸腹水类器官药敏测试方法，其特征在于，具体步骤为：吸弃培养出类器官的孔板中的培养基，加入200μlPBS润洗；加入200μl消化液于37℃消化5min，用含5％FBS的DMEM/F12终止消化；离心(4℃，200g，2min)，去除上清；加入10ml DMEM/F12重悬，用40μm细胞筛网过滤细胞；细胞计数，离心(4℃，200g，2min)，去除上清；加入胶液(含10％的Matrigel和40％Ⅰ型胶原蛋白)，5000细胞每30μl，滴于96孔板孔正中，放置培养皿至37℃，5％CO 2中10min，凝固胶液；每孔加入80μl权利要求1-3任一项的培养基，37℃，5％CO 2，细胞培养箱培养3天；加入要测试的药物，继续培养5天；进行细胞活力测试。
8.如权利要求7所述的胸腹水类器官药敏测试方法，其特征在于，上述消化液的成份为DMEM/F12含有胰酶0.1％，dispase Ⅱ 0.2％，collagenase Ⅲ 0.1％,insulin 2.5μg/ml ,Hepes 0.5M ,EGF 10ng/ml。
权 利 要 求 书1/1页CN 110129270 A
一种胸腹水类器官培养基、培养方法及药敏测试方法
技术领域
[0001]本发明涉及类器官培养领域，进一步涉及胸腹水类器官培养领域，特别是用于肿瘤患者术后胸腹水中残留癌组织或癌细胞3D培养的培养基、类器官培养方法及药敏测试方法。
背景技术
[0002]癌性胸腹水，也叫恶性胸腹腔积液，是中晚期癌症常见的并发症之一，也是部分患者的主要临床症状或体征，严重的胸、腹水甚至可危及生命。恶性胸水的疾病常见于肺癌、乳腺癌，其次为恶性淋巴瘤、卵巢癌、恶性胸膜间皮癌、食管癌、胃癌、贲门癌及病因不明的恶性肿瘤。
[0003]手术目前是多种肿瘤的主要手段，而辅助的作用就是消除微转移肿瘤沉积物，这种微转移沉积物可以增加癌症复发的机会。所以术后选择合适的药物进行辅助化疗，可以显著降低肿瘤的复发风险，提高患者的生存率。
[0004]现有的技术不能精确给出术后辅助指导用药的评价。对散落在胸腹腔积液的肿瘤沉积物或肿瘤细胞的培养主要是普通的二维培养技术。在二维培养条件下，癌细胞难以或不能充分表现出其来源癌组织的特性，使得培养的癌细胞与其来源癌组织对药物的反应有所差异，无法用于辅助用药指导。
[0005]虽然多种人源组织在不同的培养条件下可在体外成功培养成类器官，但是目前暂无关于癌性胸腹水类器官培养方法的研究及报道，尤其是具体的培养条件，即癌细胞收集保存方法，3D培养的培养
基和进一步作为术后辅助指导用药的药敏筛查方案尚无尝试及报道，本发明专利配方价格适中，可操作性和重复性好。
发明内容
[0006]本发明目的在于提供一种用于癌性胸腹水类器官培养方法，包括培养基及类器官培养成功后的药敏敏感性测试方案。该方法可操作性和重复性好，所用培养基配方价格适中。
[0007]本发明采用的技术方案如下：
[0008]一种胸腹水类器官的培养基成分，培养基的成分及其含量如下：B27，40-60X稀释；N-acetylysteine，1-5mM；EGF，1-100ng/ml；Noggin，50-200ng/ml；R-spondin 1，200-1000ng/ml或10-50％(v/v)条件培养基；A83-01，200-1000nM；FGF10,50-200ng/ml；FGF2，10-50ng/ml；Nicotinamide，1-20mM；Y-27632，1-20μM；Prostaglandin E2，0.1-2μM；SB202190，1-20μM；Heparin，1-5μg/ml。
[0009]进一步地，培养基的成分及其含量如下：B27，50X稀释；N-acetylysteine，2.5mM；EGF，10ng/ml；Noggin，100ng/ml；R-spondin 1，500ng/ml或30％(v/v)条件培养基；A83-01，500nM；FGF10 100ng/ml，FGF2，25ng/ml；Nicotinamide，10mM；Y-27632，10μM；Prostaglandin E2，1μM；SB202190，10μM；Heparin，2.5μg/ml。
[0010]进一步地，胸腹水为肿瘤患者术后的胸腔或腹腔积液。
[0011]本发明还公开了一种癌性胸腹水类器官培养方法，具体步骤为：收取胸腹水，加入一定体积的保存液，摇床震荡，过滤细胞，离心，去除上清，加入DMEM/F12，离心，去除上清；细胞计数，加入胶液，滴于孔板孔正中，放置培养皿，凝固胶液；每孔加入培养基，细胞培养箱培养。
[0012]进一步地，上述方法的步骤为：无菌环境收取肿瘤患者手术后胸腹水100ml，加入20ml保存液，转移至37℃、200rpm摇床震荡20min.用100μm细胞筛网过滤细胞，离心(4℃，200g，5min)，去除上清；加入10ml DMEM/F12重悬，离心(4℃，200g，5min)，去除上清；细胞计数，加入胶液(含20％的Matrigel和80％Ⅰ型胶原蛋白)，5000细胞每30μl，滴于48孔板孔正中，放置培养皿至37℃，5％CO2中10min，凝固胶液；每孔加入150μl培养基，37℃，5％CO2，细胞培养箱培养；每间隔3-4天更换一次培养基。
[0013]进一步地，所述保存液，包括以下成份：B27(0.5x)、Hepes(5mM)、dispaseⅡ(0.1％)、EGF(10ng/ml)、N2(0.5x)、Nicotinamide(5mM)、Y-27632(5μM)、A83-01(0.5μM)和SB202190(5μM)中的一种或多种。
[0014]本发明还公开了一种胸腹水类器官药敏测试方法，具体步骤为：吸弃培养出类器官的孔板中的培养基，加入200μl PBS润洗；加入200μl消化液于37℃消化5min，用含5％FBS 的DMEM/F12终止消
化；离心(4℃，200g，2min)，去除上清；加入10ml DMEM/F12重悬，用40μm 细胞筛网过滤细胞；细胞计数，离心(4℃，200g，2min)，去除上清；加入胶液(含10％的Matrigel和40％Ⅰ型胶原蛋白)，5000细胞每30μl，滴于96孔板孔正中，放置培养皿至37℃，5％CO2中10min，凝固胶液；每孔加入80μl药敏测试用培养基，37℃，5％CO2，细胞培养箱培养3天；加入要测试的药物，继续培养5天；进行细胞活力测试。
[0015]进一步地，上述消化液的成份为DMEM/F12含有胰酶0.1％，dispaseⅡ0.2％，collagenaseⅢ0.1％,insulin 2.5μg/ml,Hepes 0.5M,EGF 10ng/ml。
[0016]进一步地，上述消化后的类器官进行药敏测试时的培养基为培养类器官时用的培养基。
[0017]本发明的3D培养癌性胸腹水类器官的保存液作用温和，能使胸腹水中少量的肿瘤组织和细胞更好的保持其活力；培养基包括了多种针对于癌组织细胞培养所需要的细胞因子，信号通路调控因子，这些成份相互密切影响，协调配合，使得肿瘤组织细胞在培养过程中能够更好的表现出其固有的活性特征，实现高度近似于体内肿瘤组织的综合特性，因此培养出的肿瘤类器官对药物的反应更能体现体内肿瘤组织对临床化疗或靶向药的真实反应。
[0018]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0019]本发明中癌性胸腹水类器官的保存液和培养基针对于胸腹水中的肿瘤组织、细胞的活性特点，培养生长特点，选用了多种消化酶或细胞因子成份按照一定的比例进行调和，经过调和的保存液和培养基中各成份比例、含量适宜，使得胸腹水中的癌组织细胞能够有效的在3D环境中形成类器官。
[0020]本发明的培养基，可以有效的维持组织细胞特异性、干细胞特性、基因分型高度一致，组织形态也高度相似。除了满足科学研究的需要，在临床用药指导方面，体外类器官培养为患者的药物用药指导提供了很好的一个有益的选择。
附图说明
[0021]图1，肝癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌胸水或腹水类器官培养效果图。
[0022]图2，关键成份重要性研究，肺癌胸水和乳腺癌腹水类器官培养效果图。
[0023]图3，卵巢癌组织与腹水类器官培养效果图。
具体实施方式
[0024]下面结合附图对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明保护范围。
[0025]材料说明：
[0026]DMEM：购自GIBCO公司，DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。该类培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养。正常肿瘤组织和腹水短途运输用DMEM 4度低温保存。
[0027]DMEM/F12：购自GIBCO公司，F12培养基Ham’s F12nutrient medium动物细胞培养基，成分复杂，含有多种微量元素，最初设计用于克隆二倍体的中国地鼠卵巢细胞。起初是作为一种无血清配方设计的，现在常补加血清用于支持各种正常的和转化细胞的增殖。F12常和DMEM以1:1结合，称为DMEM/F12培养基，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点。
[0028]Matrigel：从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出Matrigel基底膜基质，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸卵巢素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。Matrigel基底膜基质在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，以及对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达的研究。
[0029]B27：购自GIBCO公司，即B27补充剂，可维持原代大鼠、小鼠和人PSC来源及胚胎来源的神经元，使人PSC来源和胚胎来源的神经干细胞(NSC)分化成神经元。
[0030]N-acetylcysteine：购自Sigma公司,N-乙酰半胱氨酸.
[0031]EGF：购自R&D公司，表皮生长因子。
[0032]Noggin，购自Peprotech公司，细胞生长蛋白成分。
[0033]R-spondin 1，购自PeproTech。
[0034]A83-01，购买自Tocris Bioscience。
[0035]FGF10：购自Peprotech公司，成纤维细胞生长因子。
[0036]Nicotinamide：购自Sigma公司，烟酰胺。
[0037]Y-27632dihydrochloride：购自Abmole Bioscience，ROCK特异性通路阻断剂。[0038]Prostaglandin E2：购自Sigma公司，前列腺素E2。
[0039]SB202190，购自Selleckchem公司。
[0040]FGF9，购自Sigma公司。
[0041]Heparin，购自Sigma公司。
[0042]实施例1
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