(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.10.02C N 103333938 A (21)申请号 201310306827.0
(22)申请日 2013.07.19
C12P 21/02(2006.01)
C07K 14/02(2006.01)
C07K 1/16(2006.01)A61K 39/29(2006.01)A61P 31/20(2006.01)A61P 1/16(2006.01)
(71)申请人深圳康泰生物制品股份有限公司
地址518000 广东省深圳市南山区科技园科
发路6号
(72)发明人甘建辉 饶洪冲 朱征宇 梁全
关敏 肖坚
(74)专利代理机构深圳市盈方知识产权事务所
(普通合伙) 44303
代理人杨贤
(54)发明名称
方法、乙肝疫苗及其生产方法
(57)摘要
本发明公开一种重组酿酒酵母表达的乙肝
表面抗原的生产方法，包括：将提取到的抗原用
XAD-4柱循环去除曲通，得到去曲通抗原样液；将
孔径为1000A 、颗粒大小为35μm ～70μm 的大孔
硅胶装入层析柱中，并用pH 值为7.6±0.2的磷
酸缓冲液平衡；将去曲通抗原样液用NaOH 调pH
值至7.6±0.2后，上样大孔硅胶柱；用pH 值为
7.2±0.2的磷酸缓冲液洗杂，在47～49℃温度下
用pH 值为8.7±0.2的硼酸缓冲液对洗杂后的大
超滤浓缩，得到澄清抗原。本发明还公开了相应的
重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原、乙肝疫苗及
其生产方法。本发明可大大降低产品污染几率、减
轻人工劳动强度、节省设备投资和维修成本、减少
设备占用空间，缩短生产时间。
(51)Int.Cl.权利要求书2页 说明书7页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书7页(10)申请公布号CN 103333938 A
*CN103333938A*
1.一种重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原的生产方法，该方法包括有用重组酿酒酵母种子培养酵母菌的酵母培养步骤、从所述酵母菌中提取抗原的抗原提取步骤和对所述抗原进行纯化的纯化步骤，所述纯化步骤包括有依次进行的粗纯化步骤和精纯化步骤，其特征在于，在所述抗原提取步骤之后和纯化步骤之前，还包括有： 去曲通步骤，将所述抗原提取步骤提取到的抗原用XAD-4柱循环去除曲通，得到去曲通抗原样液；
所述粗纯化步骤包括：
装柱步骤，将孔径为1000A、颗粒大小为35μm～70μm的大孔硅胶装入层析柱中形成大孔硅胶柱后，用pH值为7.6±0.2的磷酸缓冲液对所述大孔硅胶柱进行平衡处理；
上样步骤，将所述去曲通抗原样液用NaOH调pH值至7.6±0.2后，上样到所述大孔硅胶柱，其中，所述大孔硅胶柱与去曲通抗原样液上样量的体积比为1:1～1:3，上样温度为2～8℃；
后处理步骤，用pH值为7.2±0.2的磷酸缓冲液对上样步骤所得的大孔硅胶柱进行洗杂后，在45～49℃温度下用pH值为8.7±0.2的硼酸缓冲液对洗杂后的大孔硅胶柱进行洗脱处理并收集洗脱液，对所述洗脱液进行超滤浓缩处理，得到澄清抗原。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱处理包括：
将洗杂后的大孔硅胶柱的温度从2～8℃上升到45～49℃，上升时间控制在1.5小时以内；
在45～49℃温度下用pH值为8.7±0.2的硼酸缓冲液对洗杂后的大孔硅胶柱进行洗脱处理并收集洗脱液，洗脱处理时洗脱线速度不超过80厘米/小时，洗脱液的pH值控制在7～9；
将洗脱液降温至2～8℃，再进行超滤浓缩处理。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原提取步骤之中还包括：
蛋白酶抑制步骤，在所述抗原提取步骤提取到的抗原中加入蛋白酶抑制剂。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精纯化步骤具体包括：
将所述澄清抗原依次经过丁基琼脂糖疏水层析，硫氰酸盐转型处理，并用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为20～81ug/ml，除菌过滤后，得到HBsAg原液。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酵母培养步骤包括：
将表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种依次经锥形瓶、种子罐、生产罐进行发酵培养，收获酵母菌；
所述抗原提取步骤包括：经高压匀浆器破碎酵母菌，滤膜过滤除去酵母菌碎片，得到抗原。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种为美国默克公司生产的以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种。
7.一种重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原，其特征在于：该乙肝表面抗原采用如权利要求1-6中任一项所述的方法生产制得。
8.一种乙肝疫苗，其特征在于：该乙肝疫苗的活性成分包括有如权利要求7所述的重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原。
9.一种乙肝疫苗的生产方法，其特征在于，该方法包括如权利要求1-6中任一项所述的重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原的生产方法。
重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原及其生产方法、乙肝疫
苗及其生产方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物制药技术，尤其涉及一种重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原及其生产方法、乙肝疫苗及其生产方法。
背景技术
[0002] 乙行肝炎病毒（HBV）是一种DNA病毒，HBV感染呈世界性流行，但不同地区HBV感染的流行强度差异很大。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。
[0003] 我国是乙型肝炎高流行区，每年平均报告发病人50多万例。多年来乙肝发病数和发病率在我国法定报告传染中，一直高居前列，给病人、家庭、社会造成沉重的经济负担，是我国现阶段最突出的公共卫生问题之一。乙型肝炎难治易防，接种乙肝疫苗是预防乙肝最有效、最经济的方法。
[0004] 1989年，美国（默沙东）默克公司与中国政府达成了技术转让许可协议，向中国转让当时最为先进的基因工程乙肝疫苗生产技术。我司从美国默克公司引进的基因重组酵母乙肝疫苗工业化生产技术，自1994年投产以来，累计销售2亿多人份，使得超过2亿的中国儿童得到了有效保护，安全性和有效性得到了极高的评价。
[0005] 我国从美国默克公司引进的基因重组酵母乙肝疫苗工业化生产技术，其生产乙肝表面抗原蛋白（HBsAg）的工艺主要包括：酵母培养→细胞破碎液→微过滤→硅胶吸附粗提纯→疏水吸附精提纯。其中硅胶吸附粗提纯的工艺方法是：硅胶悬浮搅拌→硅胶沉降清洗→离心收集沉淀→硼酸缓冲液洗脱抗原→离心收集上清，得到粗纯样品硅胶洗脱液（简称离心法）。在这一粗提纯工艺中，须使用8～10台大容量中速离心机，生产操作时间为4天，手工操作强度大，工艺不能完全在密闭系统中完成。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原的生产方法，该方法可大大降低产品污染几率、减轻人工劳动强度、节省设备投资和维修成本、减少设备占用空间，缩
短生产时间。
[0007] 本发明进一步所要解决的技术问题是：提供一种重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原，抗原污染率低，且生产工艺简单、生产时间短、占用生产设备少、生产成本低。
[0008] 本发明进一步所要解决的技术问题是：提供一种乙肝疫苗，该乙肝疫苗污染率低，且生产工艺简单、生产时间短、占用生产设备少、生产成本低。
[0009] 本发明进一步所要解决的技术问题是：提供一种乙肝疫苗的生产方法，该方法可大大降低产品污染几率、减轻人工劳动强度、节省设备投资和维修成本、减少设备占用空间，缩短生产时间。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0011] 一种重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原的生产方法，该方法包括有用重组酿酒酵母种子培养酵母菌的酵母培养步骤、从所述酵母菌中提取抗原的抗原提取步骤和对所述抗原进行纯化的纯化步骤，所述纯化步骤包括有依次进行的粗纯化步骤和精纯化步骤，在所述抗原提取步骤之后和纯化步骤之前，还包括有：
[0012] 去曲通步骤，将所述抗原提取步骤提取到的抗原用XAD-4柱循环去除曲通，得到去曲通抗原样液；
[0013] 所述粗纯化步骤包括：
[0014] 装柱步骤，将孔径为1000A、颗粒大小为35μm～70μm的大孔硅胶装入层析柱中形成大孔硅胶柱后，用pH值为7.6±0.2的磷酸缓冲液对所述大孔硅胶柱进行平衡处理；[0015] 上样步骤，将所述去曲通抗原样液用NaOH调pH值至7.6±0.2后，上样到所述大孔硅胶柱，其中，所述大孔硅胶柱与去曲通抗原样液上样量的体积比为1:1～1:3，上样温度为2～8℃；
[0016] 后处理步骤，用pH值为7.2±0.2的磷酸缓冲液对上样步骤所得的大孔硅胶柱进行洗杂后，在45～49℃温度下用pH值为8.7±0.2的硼酸缓冲液对洗杂后的大孔硅胶柱进行洗脱处理并收集洗脱液，对所述洗脱液进行超滤浓缩处理，得到澄清抗原。
[0017] 优选地，所述洗脱处理包括：
[0018] 将洗杂后的大孔硅胶柱的温度从2～8℃上升到45～49℃，上升时间控制在1.5小时以内；
[0019] 在45～49℃温度下用pH值为8.7±0.2的硼酸缓冲液对洗杂后的大孔硅胶柱进行洗脱处理并收集洗脱液，洗脱处理时洗脱线速度不超过80厘米/小时，洗脱液的pH值控制在7～9；
[0020] 将洗脱液降温至2～8℃，再进行超滤浓缩处理。
[0021] 优选地，所述抗原提取步骤之中还包括：
[0022] 蛋白酶抑制步骤，在所述抗原提取步骤提取到的抗原中加入蛋白酶抑制剂。[0023] 优选地，所述精纯化步骤具体包括：
[0024] 将所述澄清抗原依次经过丁基琼脂糖疏水层析，硫氰酸盐转型处理，并用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为20～81ug/ml，除菌过滤后，得到HBsAg原液。
[0025] 优选地，所述酵母培养步骤包括：
[0026] 将表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种依次经锥形瓶、种子罐、生产罐进行发酵培养，收获酵母菌；
[0027] 所述抗原提取步骤包括：经高压匀浆器破碎酵母菌，滤膜过滤除去酵母菌碎片，得到抗原。
[0028] 优选地，所述表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种为美国默克公司生产的以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种。
[0029] 相应地，本发明还公开了一种重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原，该乙肝表面抗原采用上述任一种方法生产制得。
[0030] 相应地，本发明还公开了一种乙肝疫苗，其特征在于：该乙肝疫苗的活性成分包括有上所述的重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原。
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