(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010740633.1
(22)申请日 2020.07.28
(71)申请人 翌圣生物科技（上海）有限公司
地址 200120 上海市浦东新区天雄路166弄
1号楼402室
(72)发明人 李真真 王家庭 曹振 宋东亮
周其好
(74)专利代理机构 上海宣宜专利代理事务所
(普通合伙) 31288
代理人 刘洁瑜
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6806(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种制备环状ssDNA的方法及
其试剂盒，该方法包括步骤：1)将样本gDNA打断；
2)构建DNA文库，其中扩增引物中有一条具有5’
磷酸修饰；3)将文库双链中5’磷酸修饰的一条链
酶切消化；4)对另一条链进行5’磷酸化；5)用连
接酶和splint oligo进行环化。该试剂盒包括：
适用于底物是5’磷酸化的双链DNA的核酸外切
酶、5’端磷酸化酶、连接酶、splint oligo。该方
法具有可以避免环状dsDNA的形成，提高样本测
点。
权利要求书1页 说明书4页序列表1页 附图1页CN 112063688 A 2020.12.11
C N 112063688
A
1.一种制备环状ssDNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将样本gDNA打断；
2)构建DNA文库，其中扩增引物中有一条具有5’磷酸修饰；
3)将文库双链中5’磷酸修饰的一条链酶切消化；
4)对另一条链进行5’磷酸化；
5)用连接酶和splint oligo进行环化。
2.如权利要求1所述的制备环状ssDNA的方法，其特征在于，文库双链中所述5’磷酸修饰的一条链为非目的链，所述另一条链为目的链。
3.如权利要求1所述的制备环状ssDNA的方法，其特征在于，步骤3)中酶切使用的酶为Lambda核酸外切酶。
4.如权利要求3所述的制备环状ssDNA的方法，其特征在于，步骤3)中酶切的反应条件为37±1℃30±2
min，95±1℃3±0.5min，80±1℃10±0.5min，冰浴3±0.5min。
5.如权利要求1所述的制备环状ssDNA的方法，其特征在于，步骤4)中磷酸化使用的酶为T4 PNK。
6.如权利要求1所述的制备环状ssDNA的方法，其特征在于，还包括步骤：6)加入核酸外切酶消化残留的未成环及线性DNA。
7.一种用于制备环状ssDNA的试剂盒，其特征在于，包括：适用于底物是5’磷酸化的双链DNA的核酸外切酶、5’端磷酸化酶、连接酶、splint oligo。
8.如权利要求7所述的用于制备环状ssDNA的试剂盒，其特征在于，还包括扩增引物对，用于目的链的引物不具有磷酸修饰，用于非目的链的引物具有磷酸修饰。
9.如权利要求7所述的用于制备环状ssDNA的试剂盒，其特征在于，还包括未成环及线性DNA消化酶。
10.一种用于如权利要求1所述制备环状ssDNA的方法的扩增引物对，其特征在于，用于目的链的引物不具有磷酸修饰，用于非目的链的引物具有磷酸修饰。
权 利 要 求 书1/1页CN 112063688 A
一种制备环状ssDNA的方法及其试剂盒
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及二代测序技术，尤其涉及一种制备环状ssDNA的方法及其试剂盒。
背景技术
[0002]下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)是对一代测序技术的革命性改变，该技术具有高通量与低成本(单碱基)的特点。高通量测序技术的出现使得人类基因组测序成本直接下降5000倍，为人类基因组计划的顺利进行提供了重大助力。NGS技术在不停的进步，测序数据量也增加了100-1000倍，但由于其本身的特点，准确度不如一代测序。
[0003]为有效提高测序准确性，BGISEQ测序平台采用DNBSEQ TM技术。与Illumina“桥式扩增”相比，该技术基于滚环扩增，放大扩增信号的同时，可避免错误扩增的累计，从而提高测序准确性。而环状ssDNA的制备则是NGS文库与DNB的“过渡桥梁”。
[0004]目前，MGI平台的ssDNA的制备方法：文库高温变性，急速降温防止双链DNA复性，一段寡核苷酸链-splint oligo辅助成环，ligase连接成环，最后酶切消化未成环及线性DNA。这种环状ssDNA制备方法基于高温变性，但文库高温变性(解链)程度则是基于文库中GC含量的高低。文库GC含量越高，
则变性需要的温度越高；但温度过高，易损伤文库DNA链。这就导致这种状ssDNA制备方法的高GC含量样本的测序均一性差。
发明内容
[0005]为了改善高GC含量样本测序的均一性，本发明提供了一种制备环状ssDNA的方法。本发明可应用于BGISEQ测序平台建库试剂-环状ssDNA制备中。
[0006]首先，本发明提供了一种制备环状ssDNA的方法，该方法包括以下步骤：
[0007]1)将样本gDNA打断；
[0008]2)构建DNA文库，其中扩增引物中有一条具有5’磷酸修饰；
[0009]3)将文库双链中5’磷酸修饰的一条链酶切消化；
[0010]4)对另一条链进行5’磷酸化；
[0011]5)用连接酶和splint oligo进行环化。
[0012]上述环状ssDNA制备方法的流程如图1所示。
[0013]优选地，文库双链中所述5’磷酸修饰的一条链为非目的链，另一条链为目的链，即之后进行5’磷酸化及环化的单链为目的单链。进一步优选地，扩增引物中下游引物具有5’磷酸修饰，而上游引物不具有5’磷酸修饰。
[0014]优选地，步骤3)中酶切使用的酶为Lambda核酸外切酶，如NEB-M0262S。
[0015]优选地，步骤3)中酶切的反应条件为37±1℃30±2min，95±1℃3±0.5min，80±1℃10±0.5min，冰浴3±0.5min。
[0016]优选地，步骤4)中磷酸化使用的酶为T4 PNK。
[0017]优选地，步骤4)的磷酸化和步骤5)的连接同步进行，其反应条件为37±1℃30±2min。
[0018]进一步，所述制备方法还包括步骤：6)加入核酸外切酶消化残留的未成环及线性DNA；优选地，该步骤中所述核酸外切酶为Exonuclease I和/或Exonuclease III，如E.coli，NEB-M0293V和E.coli，NEB-M0206V；优选地，消化条件为37±1℃60±5min。[0019]进一步，所述制备方法还包括步骤：7)用磁珠进行纯化。
[0020]本发明另一个方面提供了一种用于制备环状ssDNA的试剂盒，该试剂盒包括：适用于底物是5’磷酸化的双链DNA的核酸外切酶、5’端磷酸化酶、连接酶、splint oligo；其中，适用于底物是5’磷酸化的
双链DNA的核酸外切酶优选为Lambda核酸外切酶，5’端磷酸化酶优选为T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)。
[0021]优选地，上述用于制备环状ssDNA的试剂盒还包括扩增引物对，其中用于目的链的引物(上游引物)不具有磷酸修饰，用于非目的链的引物(下游引物)具有磷酸修饰。[0022]优选地，上述用于制备环状ssDNA的试剂盒还包括未成环及线性DNA消化酶，优选为DNA核酸外切酶，如Exonuclease I和/或Exonuclease III。
[0023]优选地，上述用于制备环状ssDNA的试剂盒还包括磁珠，优选为HieffNGS TM DNA Selection Beads。
[0024]最后，本发明还提供了一种用于本发明方法制备环状ssDNA的扩增引物对，其中用于目的链的引物(上游引物)不具有磷酸修饰，用于非目的链的引物(下游引物)具有磷酸修饰。
[0025]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0026] 1.本发明可以避免环状dsDNA的形成，提高样本测序质量；
[0027] 2.本发明可以改善高GC含量样本的测序均一性。
[0028]以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
[0029]图1是本发明环状ssDNA的制备原理流程图；
[0030]图2是常规环状ssDNA的制备原理流程图。
具体实施方式
[0031]实施例1本发明方法制备嗜盐杆菌(GC％＝64)环状ssDNA
[0032]1、扩增引物合成：
[0033]根据本发明制备环状ssDNA的方法合成引物，并将引物Ad153_PCR 2-2进行5’phos 修饰，获得引物对如下：
[0034]Ad153_PCR 2-1：GAACGACATGGCTACGA(SEQ No.1)
[0035]Ad153_PCR 2-2：5’-p-TGTGAGCCAAGGAGTTG(SEQ No.2)
[0036]2、构建嗜盐杆菌文库(MGI平台)：
[0037]A、样本选择：本实例中选择GC含量在64％的嗜盐杆菌；
[0038]B、DNA片段化：将样本gDNA打断，本实例中选择的片段化方法为机械法；
[0039]C、文库构建：采用Ultima DNA Library Prep Kit for式剂盒，具体详见建库kit说明书；其中将扩增引物替换为上述合成引物；构建完成的嗜盐杆菌文库通过HieffNGS TM DNA Selection Beads磁珠进行分选，主带大小在300bp；
[0040]3、制备环状ssDNA：制备原理流程见图1
[0041]A、取1pmol分选后的嗜盐杆菌文库，加入Lambda核酸外切酶(NEB-M0262S)2μL、splint oligo 2μL，然后经过37℃30min，95℃3min，80℃10min处理后，立即置于冰上3min；[0042]B、冰浴完成后，加入T4 PNK 40U和连接酶5μL，之后经37℃30min(磷酸化/连接)，80℃10min处理；
[0043]C、之后加入Exonuclease li，NEB-M0293V)0.25μL、Exonuclease III (E.coli，NEB-M0206V)0.25μL，经37℃1h，80℃10min处理；
[0044]D、上述环化后的溶液60μL，加入120μLHieffNGS TM DNA Selection Beads进行纯化，然后用22μL TE buffer洗脱。
[0045]对比例常规方法制备嗜盐杆菌(GC％＝64)环状ssDNA
[0046]1、文库构建：
[0047]采用Hieff Ultima DNA Library Prep Kit for式剂盒，具体详见建库kit说明书；其中扩增引物对为：
[0048]Ad153_PCR 2-1’：5’-p-GAACGACATGGCTACGA(SEQ No.3)
[0049]Ad153_PCR 2-2’：TGTGAGCCAAGGAGTTG(SEQ No.4)
[0050]构建完成的嗜盐杆菌文库通过HieffNGS TM DNA Selection Beads磁珠进行分选，主带大小在300bp；
[0051]2、常规环状ssDNA制备方法：原理流程见图2
[0052]A、取1pmol分选后的嗜盐杆菌文库，加入splint oligo 2μL，然后经过98℃3min处理后，立即置于冰上3min；
[0053]B、冰浴完成后，加入连接酶5μL，之后经37℃15min处理；
[0054]C、之后加入Exonuclease li，NEB-M0293V)0.25μL、Exonuclease III (E.coli，NEB-M0206V)0.25μL，经37℃1h、80℃10min处理；
[0055]D、上述环化后的溶液60μL，加入120μL HieffNGS TM DNA Selection Beads进行纯化，然后22μL TE buffer洗脱。
[0056]实施例2高通量测序及结果分析
[0057]在本实例中，我们以嗜盐文库为模板，采用上述2种环化方式制备单链环状ssDNA，送MGI测序平台，在同一测序仪同一条lane进行测序，测序仪为BGISEQ-2000，模式PE100，测序数据量1G；测序数据质量见表1和表2。
[0058]表1不同环化ssDNA制备方法-测序质量对比1
[0059]
[0060]表2不同环化ssDNA制备方法-测序质量对比2
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议