(10)申请公布号 CN 102091329 A
(43)申请公布日 2011.06.15C N 102091329 A
*CN102091329A*
(21)申请号 201110032529.8
(22)申请日 2011.01.30
A61K 39/23(2006.01)
A61P 31/20(2006.01)
(71)申请人哈药集团生物疫苗有限公司
地址150069 黑龙江省哈尔滨市香坊区哈平
路新发屯
(72)发明人姜力 藏玉婷 柴华 王彬 王琪
任德强 戴秀莉 张智明 武佳斌
张明艳 张婷婷
(74)专利代理机构北京科龙寰宇知识产权代理
有限责任公司 11139
代理人孙皓晨
余光军
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了猪细小病毒灭活疫苗的制备方
法，包括：(1)将猪细小病毒弱毒株接种ST 细胞， 到生物反应器中的细胞生长液中，搅拌；(3)将ST
细胞接入到生物反应器中的微载体中进行细胞的
繁殖培养；(4)将猪细小病毒生产种毒感染生物
反应器中悬浮培养的ST 细胞进行病毒的繁殖培
养；(5)收获繁殖的病毒液，灭活，配苗，即得。本
发明方法细胞维持时间长，细胞活力高、活细胞密
度大，有利于病毒的持续繁殖，所制备的病毒液病
毒滴度高。本发明方法的生产过程衔接紧密、顺
畅，规模放大容易，猪细小病毒的收获方便，质量
稳定，可显著降低生产成本、有效提高疫苗产量和
质量。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 1 页
1.一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，包括：(1)将猪细小病毒(Porcineparvo viurs)弱毒株接种ST细胞，培养得到生产种毒；(2)将处理后的微载体加入到生物反应器的细胞生长液中，搅拌；(3)将ST细胞接入到生物反应器的微载体中，搅拌，进行细胞的繁殖培养；(4)将猪细小病毒生产种毒感染生物反应器中悬浮培养的ST细胞，进行病毒的繁殖培养；(5)收获繁殖的病毒液，灭活，配苗，即得。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的猪细小病毒弱毒株是猪细小病毒弱毒L株，其微生物保藏号是：CGMCC No.3352。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的微载体是Cyotdex 型系列微载体，优选为Cytodex-1型微载体；所述的预处理方式包括：硅化、水化和平衡。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中将预处理后的微载体按照每升细胞生长液中含有5-7g的微载体的配比比例加入到细胞生长液中。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的搅拌速度为40rpm；所述的搅拌时间为20-40min，优选为30min。
6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的搅拌包括：首先在转速为80rpm的速
度下搅拌1-3分钟，再将转速调整为50-60rpm；优选的，在转速为80rpm 的速度下搅拌1-3分钟，再将转速调整为50rpm。
7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)采用灌注培养法进行细胞的繁殖培养，包括将培养温度逐步调整至37℃，培养液的pH值控制为7.0。
8.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中将猪细小病毒生产种毒以感染复数为0.001MOI、0.01MOI、0.05MOI感染生物反应器中悬浮培养的ST细胞进行培养；优选的，步骤(4)中将猪细小病毒生产种毒以感染复数为0.01MOI感染生物反应器中悬浮培养的ST细胞，搅拌，采用灌注培养法进行病毒的繁殖培养。
9.按照权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的灌注培养温度为35℃，培养液的pH值为7.4，所述的搅拌速度为50-60rpm。
10.权利要求1-9任何一项制备方法制备得到的猪细小病毒灭活疫苗。
猪细小病毒灭活疫苗的制备方法及其产品
技术领域
[0001] 本发明涉及一种兽用活疫苗的制备方法，尤其涉及一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法以及由该方法制备得到的猪细小病毒灭活疫苗，属于猪细小病毒灭活疫苗的制备领域。
背景技术
[0002] 猪细小病毒(Porcineparvo viurs，PPV)可引起猪的繁殖障碍，主要表现为胎儿和胚胎的感染和死亡，而母体通常并不表现临床症状。血清学阴性母猪主要在妊娠的前半期经口鼻感染病毒，结果免疫机能不全的胎儿经胎盘受到感染，从而导致发病。经检查得知在世界各地的猪中，该病毒是普遍存在的，在大多数猪场呈地方性流行。此病流行很广，在欧、美、亚及大洋洲很多国家均有报道。我国的各省市相继分离到猪细小病毒，血清阳性率很高。本病对养猪业的危害极大。由于PPV目前尚无有效的药物方法，因此，该病的预防免疫就显得更为重要。
[0003] 体外培养的动物细胞有两种类型，一种是非贴壁性细胞，培养时不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，胞体为圆形。来源于血液、淋巴组织的细胞，多数肿瘤细胞和部分转化细胞属于这一类型，其培养方式类似微生物培养方式；另一种是贴壁依赖性细胞，培养时能贴附在支持物表面生长。当细胞贴附在支持物上后，会迅速铺展，然后开始有丝分裂，进入对数生长期，数天后可长成致密的细胞单层。成纤维细胞、上皮细胞以及Vero细胞、BHK 细胞、ST细胞等大多数动物细胞都属于此类型。目前中国生物制品生产上培养贴壁依赖性细胞如Vero、ST细胞等多采用传统转瓶培养或静置培养，
该工艺因具有技术成熟投资量小的特点而被广泛应用，但其生产中细胞所能增殖的区域仅限于培养瓶的有限面积，培养的环境条件难以监测和控制，因此细胞密度低，而且劳动强度大，操作过程不易控制，发生污染，疫苗产量及质量受到极大限制。
[0004] 1967年，Van Wezal首次开发了微载体系统，创建了生物反应器微载体培养细胞工艺，使动物细胞培养进入高密度培养阶段。微载体是直径为60-50μm的微珠。由于微载体本身所占体积和质量不大，但有很大的有效面积可供细胞附着，大大提高了生产效率。微载体最早使用的材料是离子交换凝胶(DEAE-SephadexA-50)，轻微搅动即可悬浮于培养基中。这种载体对细胞具有一定毒性，并且对培养液pH值也有一定影响。后来根据细胞生长特点，对微载体进行了改良，使其带有电荷或其它介质，更利于细胞的附着和生长。目前微载体己有葡聚糖微载体、聚苯乙烯微载体、中空玻璃微载体、交联明胶微载体、纤维素微载体、聚苯烯酞胺微载体等多种不同制造材料类型。其中，使用较多的是Cyotdex型系列微载体(Cytodex1，Cytodex2，Cytodex3)，它们都是带有不同基团的葡聚糖交联而成的大分子。Cytodex1整个载体带有正电荷，用于传代细胞如Vero、CHO细胞的培养；Cytodex2仅表面带有正电荷；Cytodex3不带电荷，其外表被胶原层包裹，胶原是豚鼠皮肤的提取物，同样适于细胞的附着生长。第一个工业化应用微载体的是1980年Meignier等用于口蹄疫病毒疫苗的制造，及后来的小儿麻痹疫苗的生产制造。
[0005] 采用生物反应器/微载体系统培养动物细胞，细胞贴附于微载体上，悬浮于培养基中，逐渐分裂
生长成单层细胞。该培养模式把单层培养和悬浮培养融合起来，具有以下优点：
[0006] (1)表面积/体积比大，单位体积培养细胞的产率高。如1mg Cytodex1微载体表面积可达5-6cm2，较传统的单层细胞培养面积大大增加。
[0007] (2)改良后的微载体无毒性，其大小和表面性质更适宜细胞生长，而且具有一定的透明度，便于显微镜观察细胞生长情况。
[0008] (3)微载体悬浮于培养基中，细胞生长环境均一，简化了培养条件的监测和控制，同时培养基利用率高。
[0009] (4)采样重演性好，收获过程不复杂，劳动强度小，占用空间小，操作简便，所需人员少，工艺容易放大生产。
[0010] 目前通过ST细胞静态培养增殖猪细小病毒(PPV)病毒液，已被广泛应用，然而目前所用转瓶系统培养ST细胞生产疫苗的工艺，虽技术简单，但劳动强度大，即使简单的换液都需付出巨大的劳动，且染菌风险大。应用生物反应器系统和微载体培养贴壁细胞具有高比表面积、细胞产量高，悬浮培养系统便于监测、控制和取样，生产规模容易放大，不易染菌等优点，工业上被广泛应用于生产如狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒等疫苗。
[0011] 但是，利用生物反应器系统和微载体培养ST细胞生产PPV疫苗存在着猪细小病毒液培养产量偏低、不易规模放大、成本过高、疫苗质量不稳定等缺陷，这些缺陷严重影响或制约了该方法在实际生产中的应用，有待改进。
发明内容
[0012] 本发明所要解决的技术问题是克服现有的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法中所存在的猪细小病毒液培养产量偏低、不易规模放大、成本过高、疫苗质量不稳定等缺陷，提供一种新的猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，该制备方法利用生物反应器微载体悬浮培养ST细胞高效生产猪细小病毒液，对生产工艺参数进行了优化，该方法具有所生产的猪细小病毒液病毒滴度高，能够规模化工业生产、成本低、疫苗质量稳定等优点。
[0013] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0014] 一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法，包括：(1)将猪细小病毒弱毒株接种ST细胞，培养得到生产种毒；(2)将处理后的微载体加入到生物反应器的细胞生长液中，搅拌；
(3)将ST细胞接入到生物反应器的微载体中进行搅拌，进行细胞的繁殖培养；(4)将猪细小病毒生产种毒感染生物反应器中悬浮培养的ST细胞，进行病毒的繁殖培养；(5)收获繁殖的病毒液，灭活，配苗，即得。
[0015] 本发明制备方法中，所述的猪细小病毒弱毒株可以是猪细小病毒弱毒L株，其微生物保藏号是：CGMCC No.3352；
[0016] 其中，步骤(2)中所述的微载体可以是Cyotdex型系列微载体，更优选为Cytodex-1型微载体，所述的预处理方式包括：硅化、水化和平衡；
[0017] 优选的，步骤(2)中将预处理后的微载体按照每升细胞生长液中含有5-7g的微载体的配比比例加入到细胞生长液中；步骤(2)中所述的搅拌速度优选为40rpm；所述的搅拌时间为20-40min，优选为30min。
[0018] 本发明考察了ST细胞的不同培养方式对细胞密度的影响，实验结果发现，采用灌注培养的细胞密度明显高于批式培养的细胞密度，本发明在进行ST细胞培养时优选采用灌注培养的细胞培养方式。此外，在灌注培养中，本发明发现细胞接种浓度对于细胞的生长速度和稳定性等有显著影响，本发明通过大量的实验最终发现，当ST细胞以1×105/mL浓度接种到生物反应器中的微载体上时，第7天细胞密度就可达1×107/mL，细胞状态稳定，维持时间长，利于病毒繁殖。
[0019] 本发明人通过大量的实验发现，搅拌速度对于细胞的贴壁影响非常大。本发明通过大量的实验发现，步骤(3)中所述的搅拌采用以下搅拌速度时最有利于细胞的贴壁：首先在转速为80rpm的速度下搅拌1-3分钟，再将转速调整为50-60rpm；更优选为：首先在转速为80rpm的速度下搅拌1-3分钟，再
将转速调整为50rpm。
[0020] 其中，步骤(3)中所述的培养温度优选为37℃，培养液的pH值优选为7.0。[0021] 本发明还发现，步骤(4)中猪细小病毒生产种毒感染细胞的剂量对于病毒液的病毒滴度有着一定的影响，本发明通过实验筛选发现，将猪细小病毒生产种毒以感染复数为0.001MOI、0.01MOI、0.05MOI感染生物反应器中悬浮培养的ST细胞有利于提高病毒液的病毒滴度，尤其是将猪细小病毒毒生产种毒以感染复数为0.01MOI感染生物反应器中悬浮培养的ST细胞进行灌注培养法培养可以有效提高病毒液的病毒滴度。其中，所述步骤(4)中所述的灌注培养温度优选为35℃，培养液的pH值优选为7.4，所述的搅拌速度为50-60rpm。[0022] 本发明根据ST细胞生长代谢及病毒增殖的特点，对搅拌式生物反应器灌注培养技术应用于猪细小病毒疫苗生产进行研究，对各技术参数进行优化和筛选，使细胞增殖时培养环境稳定，并在接种病毒后细胞仍能得到足够的营养和平衡的环境；同时乳酸和氨等有毒代谢产物得以不断排除，本发明方法的细胞维持时间长，细胞活力高(≥90％)、活细胞密度大(≥1×107cells/mL)，有利于病毒的持续繁殖，所制备的猪细小病毒TCID50≥108.0。生产过程衔接紧密、顺畅，规模放大容易，生产周期短，占用场地小，环境污染少且易于处理，猪细小病毒的收获方便质量易于实现均衡稳定，可显著降低生产成本、提高疫苗产量和质量。
附图说明
[0023] 图1本发明生物反应器微载体培养ST细胞生产猪细小病毒病毒液的工艺流程图。
具体实施方式
[0024] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0025] 实验材料：
[0026] 1.细胞：ST细胞(购自中国兽医药品监察所)。
[0027] 2.毒种：猪细小病毒L株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏号：CGMCC No.3352。
[0028] 3.微载体：Cytodex-1，Pharmacia公司产品。
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