CRISPRCas之前世今⽣，您想知道的都在⾥⾯！
在⽂章中，作者就CRISPR的基础研究作了全⾯的介绍，并就CRISPR的临床应⽤和市场前景，客观的分析了CRISPR 的利与弊，详细介绍CRISPR/Cas的前世今⽣。希望⼤家能够从中有所收获。 CRISPR/Cas的原理
⼀
前⾔
提到CRISPR，⼤家⽿熟能详的可能是⿇省理⼯学院-哈佛⼤学Broad研究所、有着“CRISPR之⽗”之称的张锋，也可能是加州⼤学伯克利分校的⼥神科学家Jennifer Doudna。且不论这两个机构正在如⽕如荼上演的CRISPR专利⼤战，我们能够在实验室利⽤CRISPR来轻松实现基因编辑还得感谢这两位杰出科学家。今天我们就来看看，CRISPR到底是怎么⼯作的。 CRISPR全称是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇的规律间隔的短回⽂重复序列），⽽Cas的全称是CRISPR associated（CRISPR关联），由于名字太长，后来⼤家都简称为CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas这项技术⾃从问世以来，已经吸引了⽆数欢呼和掌声，在短短两三年之内，它已经成为了⽣物科学领域最炙⼿可热的研究⼯具，但其实CRISPR/Cas系统早就存在⾃然界中 了。CRISPR/Cas系统是⼀种原核⽣物的免疫防御系统，⽤来抵抗外来遗传物质的⼊侵，⽐如噬菌体病毒等。同时，它为细菌提供了获得性免疫（类似于哺乳动物的⼆次免疫），当细菌遭受病毒⼊侵时，会产⽣相应的“记忆”。当病毒⼆次⼊侵时，CRISPR系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达，抵抗病毒的⼲扰。是不是觉得和真核⽣物中RNA⼲扰（RNAi）的原理很相似？正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成⼀种⾼效的基因编辑⼯具。在CRISPR/Cas系统
中，CRISPR/Cas9系统是研究最深⼊，应⽤最成熟的⼀种类别。CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因⼦效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代基因组定点编辑技术。
⼆
结构介绍
CRISPR簇是⼀个⼴泛存在于细菌和古⽣菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，充当了防御外源遗传物质的“基因武器”，分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。下图展⽰了完整的CRISPR位点（Locus）的结构。其
中，CRISPR序列由众多短⽽保守的重复序列区（Repeats）和间隔区（Spacers）组成。Repeats含
有回⽂序列，可以形成发卡结构。⽽Spacers⽐较特殊，它们是被细菌俘获的外源DNA序列。这就相当于细菌免疫系统的“⿊名单”，当这些外源遗传物质再次⼊侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。⽽在上游的前导区（Leader）被认为是CRISPR序列的启动⼦。另外，在上游还有⼀个多态性的家族基因Cas，该基因编码的蛋⽩均可与CRISPR序列区域共同发⽣作⽤。Cas基因与CRISPR序列共同进化，形成了在细菌中⾼度保守的CRISPR/Cas系统。⽬前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。
三
⼯作原理
在具体的⼯作过程中，CRISPR序列和Cas蛋⽩配合，⼤体上分3步来执⾏防御功能。
外源DNA俘获
简单来说，CRISPR/Cas系统⾸先要取得⼀段外源DNA，实现“⿊名单登记”。CRISPR/Cas系统将识别出⼊侵者（⽐如
简单来说，CRISPR/Cas系统⾸先要取得⼀段外源DNA，实现“⿊名单登记”。CRISPR/Cas系统将识别出⼊侵者（⽐如病毒）的“名字”（PAM）并到它的“⾝份证”（原间隔序列），然后把⼊侵者⾝份信息作为“档案”（间隔序列）记录
到“⿊名单”（CRISPR序列）中。下图展⽰了第⼀阶段的⼯作原理。当噬菌体病毒⾸次⼊侵细菌，病毒的双链DNA被注⼊细胞内部。CRISPR/Cas系统会从这段外源DNA中截取⼀段序列作为外源DNA的“⾝份证”，然后将其作为新的间隔序列被整合到基因组的CRISPR序列之中。因此，这段与间隔序列对应的“⾝份证”被称为前间隔序列（protospacer）。然⽽，“⾝份证”的选取并不是随机的。原间隔序列向两端延伸的⼏个碱基都⼗分保守，被称为前间隔序列临近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。PAM通常由NGG三个碱基构成（N为任意碱基）。病毒⼊侵时，Cas1和Cas2编码的蛋⽩将扫描这段外源DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的前间隔序列。随 后，Cas1/2蛋⽩复合物将前间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插⼊临近CRISPR序列前导区的下游。然后，DNA会进⾏修复，将打开的双链缺⼝闭合。这样⼀来，⼀段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。
crRNA合成
⽬前的研究表明，CRISPR/Cas系统共有三种⽅式（TypeⅠ、Ⅱ、Ⅲ）来合成crRNA，CRISPR/Cas9系统属于TypeⅡ（⽬前最成熟也是应⽤最⼴的类型）。当病毒⼊侵时，CRISPR序列会在前导区的调控下转录出pre-CRISPR-derived RNA （pre-crRNA）和trans-acting crRNA（tracrRNA）。其中，tracrRNA是由重复序列区转录⽽成的具有发卡结构的RNA，⽽pre-crRNA是由整个CRISPR序列转录⽽成的⼤型RNA分⼦。随后，pre-crRNA，tracrRNA以及Cas9编码的蛋⽩将会组装成⼀个复合体。它将根据⼊侵者的类型，选取对应的“⾝份证”（间隔序列RNA），并在核糖核酸酶
Ⅲ（RNaseⅢ）的协助下对这段“⾝份证”进⾏剪切，最终形成⼀段短⼩的crRNA（包含单⼀种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区）。crRNA，Cas9以及tracrRNA组成的最终的复合物，为下⼀步剪切做好准备。
靶向⼲扰
如下图所⽰，在病毒的⼆次感染中，Cas9/tracrRNA/crRNA复合物可以对⼊侵者的DNA进⾏精确的打击。复合物会扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的前间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/前间隔序列的区域，DNA双链将被解开。crRNA将与互补链杂交，⽽另⼀条链则保持游离状态。随后，Cas9蛋⽩发挥作⽤，剪切crRNA互补的DNA 链和⾮互补的DNA链。最终，Cas9使双链断裂（DSB）形成，外源DNA的表达被沉默。
四
应⽤价值
CRISPR/Cas的强⼤之处在于，其可以对基因进⾏定点的精确编辑。在向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋⽩的共同作⽤下，细胞基因组DNA（看成外源DNA）将被精确剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要满⾜⼏个条件。第⼀，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（NGG）。第⼆，向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。最基础的应⽤就是基因敲除。如果在基因的上下游各设计⼀条向导RNA（gRNA1，gRNA2），将其与含有Cas9蛋⽩编码基因的质粒⼀同转⼊细胞中，gRNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的⽬标序列，Cas9蛋⽩会使该基因上下游的DNA双链断裂。随后⽣物体⾃⾝存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起
来，从⽽实现了细胞中⽬标基因的敲除。如果在此基础上为细胞引⼊⼀个修复的模板质粒（供体DNA分⼦），这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引⼊⽚段插⼊（Knock-in）或定点突变（site-specific mutagenesis）。这样就可以实现基因的替换或者突变。随着研究的深⼊，CRISPR/Cas技术已经被⼴泛的应⽤，除了基因敲除，基因替换等基础编辑⽅式，它还可以被⽤于基因激活，疾病模型构建，甚⾄是基因。
CRISPR：看魔剪如何征服DNA
⾸先，来看看曾经轰动⼀时的案例：中⼭⼤学研究⼈员利⽤CRISPR-Cas9校正⼈胚胎中的突变。中国
科学家利⽤CRISPR/Cas9对⼈胚胎中会导致地中海贫⾎的β珠蛋⽩基因突变成功地进⾏修饰，⽬的是希望利⽤CRISPR对这种基因突变进⾏校正，以便实现利⽤基因疗法地中海贫⾎。⽂章发表在《蛋⽩·细胞》（Protein & Cell）杂志上[1]。
β-地中海贫⾎是⼀种潜在地危及⽣命的⾎液疾病，它在全世界的患病率⼤约是⼗万分之⼀。研究⼈员利⽤来⾃⼀名β-地中海贫⾎患者的组织构建出克隆胚胎，随后对这些胚胎中的DNA进⾏了测序，发现⼀种单核苷酸错误，即应当为A的碱基被替换为了G。接下来他们研究利⽤CRISPR将这种碱基转换回去，即实现G到A。这也是⾸次证实利⽤CRISPR系统治愈⼈类胚胎中的遗传疾病是可⾏的。但这项研究造成巨⼤影响⼒的原因还有：它是在婴⼉胚胎⾥⾯开展的，虽然医⽣丢弃的是不会成功孕育出婴⼉的异常胚胎，但这点还是受到了部分学者的批评和攻击。
就在这不久之后，《新英格兰医学杂志》（NEJM）报道了巴塞尔⼤学研究⼈员利⽤CRISPR到导致红细胞增多症的第⼀个遗传突变。[2]。
通过使⽤全基因组连锁分析和基因测序，研究⼈员发现所有受影响的家族成员的EPO基因中都缺少⼀个单碱基。⽽EPO 的增加正是导致⾎红细胞过多产⽣的原因。但困惑的是，这个碱基的缺失导致了基因编码读码框架发⽣移动，最终导致EPO基因功能缺失⽽不是增强。但实际情况是，病⼈⾎液中EPO的含量是增加⽽不是降低。最终，还是CRISPR帮研究⼈员到了答案。原来，EPO基因中还有⼀个
隐藏的mRNA，正常情况下并不参与形成EPO。基因突变导致这个基因的读码框架发⽣移动，从⽽导致了这个基因产⽣了更多的EPO。
除了在⾎液⽅⾯的应⽤，CRISPR在发育⽅⾯也卓有建树。近期《⾃然》（Nature）就报道了英国和韩国的研究⼈员利⽤CRISPR/Cas9揭⽰OCT4基因在⼈胚胎早期发育中发挥着关键作⽤。在正常情形下，OCT4基因在⼈胚胎的最初⼏天
⽤CRISPR/Cas9揭⽰OCT4基因在⼈胚胎早期发育中发挥着关键作⽤。在正常情形下，OCT4基因在⼈胚胎的最初⼏天发育中是有活性的，它驱动受精卵分裂，⼤约7天后形成⼀种有⼤约200个细胞组成的球体，即囊胚。在实验中，他们⽤CRISPR/Cas9阻断⼈胚胎OCT4的表达后，这些胚胎的发育都停⽌了[3]。
CRISPR另外⼀个价值就是能够⽤来追踪细胞，这个功能在癌症⽅⾯都有着重要的作⽤。斯坦福⼤学的研究⼈员就将CRISPR基因编辑技术同DNA条形码技术结合，有效追踪癌症进展。
⼈类的癌症并不仅仅只有⼀种肿瘤抑制突变，其存在多种突变组合。为了了解不同的突变基因是如何相互作⽤的，研究⼈员们耗费了数年的努⼒来绘制图谱，包括构建多种不同谱系的遗传修饰化⼩⿏，其中每⼀种都携带不同的失活肿瘤抑制基因。⽽如果想探索所有的可能性组合，研究⼈员就需要上千只⼩⿏。
CRISPR-Cas9的强⼤之处在于，可以轻易地替换、修改或删除⽣物体内的基因序列，从⽽在单个⼩⿏的肺中创造出多种基因不同的肿瘤。问题在于，为了得出关于不同基因突变组合效应的有⽤结论，科学家需要⼀种精确的⽅法来标记追踪不同肿瘤的⽣长。但如果将CRISPR-Cas9和DNA条形码技术（利⽤⽣物体DNA中⼀段保守⽚段对物种进⾏快速准确鉴定的技术）相结合以此来追踪癌症的⽣长发展情况，就能帮助科学家们在实验室中复制出癌症患者机体中所观察到的遗传多样性。就⽐如将短的、独特的DNA序列（DNA条形码）黏附于⼩⿏肺内的单个肿瘤细胞中，这样每⼀个序列的功能就像是遗传条码，当每个癌细胞扩增时，条码的数量会随之增加。最后只需要将整个癌肺取出，然后⽤⾼通量的DNA测序和计算来分析条形码出现的频率，从⽽精确的确定肿瘤的⼤⼩。
也就是说，研究⼈员可以在同⼀个⼩⿏⾝上产⽣⼤量具有特定遗传特征的肿瘤，并在规模和精度上分别跟踪它们的⽣长。研究⼈员最终只在⼏个⽉之内就完成了相关实验，只⽤了不到24只⼩⿏。结果发表在《⾃然·遗传学》（Nature Genetics）上[4]。
⽆独有偶，Nature重量级⼦刊《⾃然·⽣物科技》（Nature Biotechnology）也报道了德国研究⼈员利⽤CRISPR/Cas9诱导的DNA瘢痕序列追踪细胞谱系[5]。
在⽣物界⼀直有⼀个问题困着⼤家，功能不同的细胞系到底来⾃于何处？⽽CRISPR有⼀个特点是总在确切的位点上进⾏切割，受此启发，德国科学家团队开发出⼀种被称作LINNAEUS（lineage tracing
by nuclease-activated editing of ubiquitoussequence, 通过对普遍存在的序列进⾏核酸酶激活的编辑来开展谱系追踪）的技术，它能够让⼈们确定细胞类型和每个细胞的谱系。
在斑马鱼胚胎细胞中如何切割DNA，在下⼀次细胞分裂发⽣之前，给DNA修复时间不超过15分钟。修复⼯作必须快速完成，这也是错误累积的地⽅，这种错误序列我们就称之为DNA瘢痕序列。DNA中的瘢痕序列具有随机的长度，⽽且它们的确切位置也会发⽣变化。⼦细胞在细胞分裂过程中遗传这些瘢痕序列。当这些瘢痕序列汇总在⼀起时就像条形码⼀样发挥作⽤，能够确定每个细胞的谱系。
因此研究⼈员设计了⼀个实验，在斑马鱼的胚胎内注⼊CRISPR-Cas9系统，这些斑马鱼事先被转⼊了红⾊荧光蛋⽩（RFP）。在接下来的时间内，Cas9重复性地切割斑马鱼体内的RFP。这些斑马鱼胚胎中的红⾊荧光逐渐消失的同时，数千个瘢痕序列在细胞中DNA损伤区域中形成。最终通过分析瘢痕序列，就能确定细胞是来⾃于哪个祖细胞。
综上所述，CRISPR在DNA 编辑⽅⾯起着重要作⽤，也衍⽣出众多的新技术。
当CRISPR遇上CAR-T：看强强如何联⼿攻克癌症
通⽤型CAR-T
⾸先让我们来聊聊通⽤型CAR-T。⽬前，市场上⼤部分的CAR-T细胞是利⽤患者⾃⾝的T细胞来⽣产
的。这个过程不仅耗时耗⼒，价格昂贵，⽽且还受限于当前的⽣产制造能⼒。如果科学家们能够想办法⽣成通⽤型的CAR-T细胞，那这类疗法将有望变得更便捷、更便宜。因为，这些现成的（off-the-shelf）细胞将增加能够接受单⼀CAR-T细胞产品的患者数量。
但有两个问题成为通⽤型CAR-T的主要障碍，移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）和宿主排斥。不过幸运的是，美国纪念斯隆凯特林癌症中⼼科学家领导的研究⼩组发现，同种异体供体CD19特异性的CAR-T细胞在杀伤肿瘤细胞的同时，所导致的GVHD发⽣的风险是最少的。⽂章发表在《Nature Medicine》上。
基于这样⼀个天然的优势，研究⼈员就想着利⽤CRISPR对CAR-T进⾏基因编辑，降低CAR-T的抗原性。CAR-T领域的先驱者Carl June教授就在《Clinical Cancer Research》杂志上发表⽂章证实，体外和动物模型研究中，⽤CIRSPR敲除TCR（T cell receptor）和B2M（β-2 microglobulin）这两个和免疫排除有关的基因后，T细胞同种异体反应性（alloreactivity）降低，且没有导致GVHD。
（alloreactivity）降低，且没有导致GVHD。
⽆独有偶，中国和英国科学家也发现，⽤CRISPR敲除TRAC （T cell receptor alpha constant chain）后可以构建的通⽤型CAR-T。
笔者在此还想补充的⼀点是，通⽤型CAR-T还有另外⼀种解读，就是同⼀种T细胞可以加载不同的抗原。这个概念是由MIT和波⼠顿⼤学的科学家提出来的。如下图所⽰，在T细胞上表达通⽤型的受体，然后这个通⽤型的受体可以连接不同的靶点抗原，开发出⼀种分离的、通⽤、可编程式CAR 系统⽤于T细胞，他们起名为SUPER CAR-T。也就是说，患有不同癌症的患者只需要输⼊同⼀种SUPER CAR-T，然后再输⼊相应的抗原（⽐如肺癌特异性抗原或者淋巴瘤特异性抗原等），这⼤⼤加快了进程。
增强型CAR-T
CRISPR除了⽤于产⽣通⽤型CAR-T，还能通过敲除免疫共抑制通路或信号分⼦的基因（如CTLA4、PD1）提⾼CAR-T细胞的功效。⽐较有代表性的就是NIH（美国国⽴卫⽣研究院）下属Recombinant DNA Advisory Committee批准的由Carl June教授领导的⼀项CRISPR临床试验。在该试验中，研究⼈员将利⽤CRISPR/Cas9在靶向⿊⾊素瘤的CAR-T中敲除编码PD-1的基因以及内源性T细胞受体的基因。此项研究由宾⼣法尼亚⼤学和它的合作伙伴—加州⼤学旧⾦⼭分校以及MD安德森癌症中⼼共同负责。《Nature Biotechnology》杂志还特意报道了该研究团队计划在I期临床试验结果。敲除PD-1之后，结果表明CAR-T的杀伤性更强。
但抑制PD-1通路也不是万能的，《Nature》杂志报道，如果在T细胞⾮霍奇⾦淋巴瘤(T-NHL)的癌症⼩
⿏模型中使⽤PD-1抑制剂免疫疗法，⾮但没发挥抗癌作⽤，⽽且还促进了肿瘤的进展。这个结果其实是在意料之中，因为在T-NHL 中，T细胞本就是肿瘤细胞，抑制了PD-1通路只会加速肿瘤⽣长。既然PD-1/PD-L1不⾏，那CAR-T能⾏吗？这时⼜出现另外⼀个问题：CAR-T细胞和癌性T细胞之间⽬标抗原的共同表达会导致CAR-T细胞的⾃相毁灭。这些问题都限制了CAR-T细胞疗法的发展。
不过不⽤担⼼，来⾃圣路易斯华盛顿⼤学医学院的科学家们利⽤基因编辑技术CRISPR对⼈类T细胞进⾏了改造，去除了CD7 和T细胞受体α链(TRAC)表达，这是⼀种针对CD7+ T细胞恶性肿瘤，避免了“⾃相残杀”的CAR-T细胞疗法(UCART7)。其能够在保护正常T细胞的情况下，对癌性T细胞发起攻击。研究结果于近⽇发表在权威学术期刊《Nature》⼦刊《Leukemia》上，结果显⽰：接受基因编辑改造的以CD7为靶点的T细胞组的⼩⿏，中位⽣存期为65天，⽽接受对照组⼩⿏的中位⽣存期仅有31天。
总结⼀下，CRISPR联合CAR-T确实能到起到1+1⼤于2的效果，⼀起强强联⼿消灭癌症。希望未来能有更多的突破出现。
深度剖析CRISPR的临床应⽤和市场前景
⼀
临床应⽤
说到临床应⽤，中国科学家在这⽅⾯拔得头筹。虽然张锋、Jennifer Doudna和Carl June等⼤⽜⼀直在争先恐后的申请临床试验，但这⼀领域的格局或许要被⼀批“默默⽆闻”的中国科学家改写了！就在2016年7⽉，《Nature》宣布，在获得了医院审查委员会的伦理批准之后，四川⼤学华西医院肿瘤学家卢铀教授将开展全球⾸个CRISPR⼈体试验，利⽤CRISPR技术编辑的T细胞，来化疗、放疗以及其它疗法⽆效的转移性⾮⼩细胞肺癌患者这⼀临床试验。事实上，中国在CRISPR领域⼀直⾏动很快，已经创造了多个第⼀，如第⼀个CRISPR编辑⼈类胚胎，第⼀个CRISPR编辑猴⼦。
试验具体操作过程就是，⾸先从患者的⾎液中提取出T细胞，然后⽤CRISPR/Cas9技术敲除PD-1基因。该基因是⼈体免疫反应的关键开关，删除它能够恢复T细胞的抗肿瘤能⼒。经CRISPR编辑后的T细胞在实验室中扩增后，再回输到患者⾎液中。当经过改造的T细胞循环到肺癌组织中时，就能不受肿瘤细胞抑制并将其消灭。这个⽅案还有⼀个值得改进的地⽅，就是研究⼩组可以选择从肿瘤部分获取T细胞，因为这些T细胞已准备好特异性攻击癌症。
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