[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101348517A
[43]公开日2009年1月21日
[21]申请号200810115278.8[22]申请日2008.06.20
[21]申请号200810115278.8
[71]申请人北京倍爱康生物技术有限公司
地址100070北京市丰台区海鹰路1号院6号楼
[72]发明人仝文斌 陈立杰 雷焱 [51]Int.CI.C07K 1/10 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页
[54]发明名称
[57]摘要
一种在氨基磁珠表面共价偶联蛋白质分子的方
分子进行活化，之后将二者混合即可将蛋白质分子
高效率共价偶联在磁珠表面。由于活化后蛋白质分
子和磁珠具有不同的活化集团，彼此之间不会发生
间的聚集现象。此外由于活化产生的巯基和马来酰
亚胺活化集团之间的反应迅速高效，保证了该方法
有很高的偶联效率和良好重复性。偶联后磁珠可广
泛用于免疫检测，细胞分选等领域。
200810115278.8权 利 要 求 书第1/1页 1.一种在氨基磁珠表面共价偶联蛋白质的方法，其特征在于，实现步骤包括：
(1)氨基磁珠的活化：混悬在磁珠活化缓冲液内磁珠表面的氨基(NH2-)与活化剂发生共价反应生成含
马来酰亚胺的化学集团。
(2)蛋白质的活化：溶解在蛋白质活化缓冲液内的蛋白质的氨基与活化剂发生共价反应生成巯基(SH-)。
(3)偶联：活化磁珠和蛋白质在磁珠偶联缓冲液内混合后通过马来酰亚胺与巯基的共价反应蛋白质被共价偶联在磁珠表面。
(4)稀释和保存：将偶联后磁珠用磁珠保存缓冲液稀释，4℃保存。
(4)偶联效果检测：利用酶联免疫测定法原理检测偶联效果。
2.根据权利要求1所述的一种在氨基磁珠表面共价偶联蛋白质的方法，其特征在于，所述的氨基磁珠活化剂为Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)或Sulfosuccinimidyl
4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate
(Sulfo-SMCC)。
3.根据权利要求1或2所述的氨基磁珠活化剂，其特征在于，活化剂SMCC或Sulfo-SMCC工作浓度为0.5～2mM。
4.根据权利要求1所述的一种在氨基磁珠表面共价偶联蛋白质的方法，其特征在于，所述的磁珠偶联效果检测方法为酶联免疫吸附试验(ELISA)或化学发光酶免疫检测法(CLIA)。
200810115278.8说 明 书第1/4页
一种在氨基磁珠表面共价偶联蛋白质的方法
技术领域
本发明属于磁性材料技术领域，特别提供了一种在氨基磁珠表面高效率共价偶联蛋白质的方法。偶联蛋白质的磁珠可用于免疫检测、细胞分选等。
背景技术
磁珠，又称磁性微粒或磁性颗粒，是一类直径在纳米或微米级的球形复合材料。磁珠的核心由四氧化三铁或三氧化二铁等超顺磁性材料构成，外围包覆聚苯乙烯或葡聚糖等高分子材料。核心物质赋予磁珠超顺磁性，使磁珠可以在外加磁场作用下向磁场方向移动达到分离的目的；外围高分子材料可以通过物理或化学的方法活化产生氨基(N H2-)、羧基(C O O H-)或羟基(O H-)等集团，可以被利用与蛋白质或核酸等生物活性分子偶联。偶联后磁珠广泛用于蛋白质分离纯化、细胞分选、微生物分离和核酸分离等领域。
氨基磁珠，即表面含有氨基集团的磁珠，是容易获得的一类磁珠。目前氨基磁珠与蛋白质的偶联多采用以戊二醛为偶联剂的方法。戊二醛在其分子两端各有一个醛基，醛基可与氨基(NH2-)发生共价反应。在理想情况下戊二醛的一个醛基与磁珠的氨基反应，另一个与蛋白质氨基反应，将两者偶联。由于戊二醛是单功能集团的生物偶联剂(Homobifunctional Cross-linker)，由它介导的连接反应没有方向性，除了可引起磁珠与蛋白质的偶联外，还可引起蛋白质之间或磁珠之间的接合，因而偶联效率较低，还会引起磁珠自身聚集。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在氨基磁珠表面高效率共价偶联蛋白质的方法，解决戊二醛偶联法偶联效
率低和磁珠聚集的问题。
本发明的主要技术方案是利用两种活化剂分别活化磁珠和蛋白质，然后将二者混合进行偶联，包括以下几个步骤：
(1)磁珠的活化：磁珠用磁珠活化缓冲液清洗1～2次后用该缓冲液重悬，加入磁珠活化剂Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)或Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC)。室温混悬反应15分钟。加入甘氨酸缓冲液，室温混悬反应10分钟中止反应。活化后磁珠用偶联缓冲液洗涤3次后，用该溶液重悬后保存于4℃备用(12小时内用于偶联有效)。
(2)蛋白质的活化：蛋白质在4℃条件下用蛋白质活化缓冲液透析过夜(＞12小时)后，加入活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)，室温反应30分钟。加入甘氨酸缓冲液室温反应5分钟终止反应。用Sephadex G25谱柱纯化活化后蛋白质，纯化所用缓冲液为蛋白质活化缓冲液。活化后蛋白质保存于4℃备用(12小时内用于偶联有效)。
(3)偶联：将活化后磁珠与活化后蛋白质混合，室温混悬条件下反应12～16小时。磁分离，保留上
清溶液用于偶联效率检测。磁珠用磁珠保存缓冲液洗涤3次后稀释到一定浓度，4℃保存。
(4)检测偶联效率：测量偶联后上清溶液中蛋白浓度并计算蛋白含量，此为未结合蛋白含量。蛋白总量减去未结合蛋白含量除以蛋白总量即为蛋白偶联效率。
(5)检测磁珠偶联效果：用酶联免疫检测原理，利用可与偶联蛋白质特异反应的的生物酶标记分子(如酶标记抗体)为指示剂。偶联后磁珠用磁珠保存缓冲液倍比稀释。稀释后磁珠与指示剂溶液混合，37℃反应10分钟。洗涤磁珠后加入酶催化底物，显并中止。磁分离，测量上清吸光度值。吸光度值会在磁珠的某一稀释度出现明显下降。该稀释度能反映磁珠偶联效果，稀释度越高偶联效果越好。
上述的磁珠活化缓冲液为0.03M三乙醇胺，3M NaCl，pH7.6缓冲液。
上述的磁珠偶联缓冲液为0.1M三乙醇胺，0.1M NaCl，pH7.0缓冲液
上述的蛋白质活化缓冲液为0.1M三乙醇胺，0.1M N a C l，1m M E D T A，p H8.5缓冲液上述的蛋白质偶联缓冲液为0.1M三乙醇胺，0.1M N a C l，1m M E D T A，p H7.3缓冲液上述的磁珠保存清洗缓冲液为0.01M Tris，0.15M NaCl，0.1％w/v BSA，0.1％NaN3，0.001M EDTA pH 7.4缓冲液
本发明具有如下优点：
1.本发明具有蛋白偶联效率高和重复性好的特点：蛋白质活化剂2IT与蛋白质的氨基反应生成巯基(S H-)，磁珠活化剂S M C C或S u l f o-S M C C与磁珠氨基反应生成含马来酰亚胺的化学集团。两者混合
后，巯基与马来酰亚胺迅速发生结合反应将蛋白质共价偶联在磁珠表面。由于活化蛋白质和活化磁珠具有不同的功能集团，彼此之间不会反应，因而有效的避免了蛋白质之间或磁珠之间的聚集，此外巯基与马来酰亚胺集团的反应快速高效，可以大幅度的提高蛋白质偶联效率，也保证了该方法的良好重复性。
2.本发明不影响偶联在磁珠上的蛋白质的生物学活性：(1)活化和偶联反应发生的温度、离子强度、pH等条件温和，不会引起蛋白质变性。(2)蛋白质与磁珠偶联后后两者之间形成10余个碳分子的长臂，有效的避免了固相载体的空间位阻效应对蛋白质活性的影响。
附图说明
图1Sulfo-SMCC/SMCC活化氨基磁珠反应示意图。
图22IT活化蛋白质反应示意图。
图3活化后磁珠与活化后蛋白质反应示意图。
图4本方法与传统戊二醛法偶联效果比较。
具体实施方法
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例：氨基磁珠偶联绵羊抗小鼠多克隆抗体
(1)磁珠的活化：在磁珠表面生成含马来酰亚胺的化学集团。活化方法包括：
(1.1)磁珠预处理：取100m g氨基磁珠胶体溶液在磁场作用下沉降(磁分离)10分钟，去上清，沉降的磁珠用磁珠活化缓冲液清洗2次，每次用量5ml。
(1.2)将洗涤后磁珠用1ml活化缓冲液充分混悬后加入活化剂Sulfo-SMCC，室温混悬反应15分钟，Sulfo-SMCC反应浓度为1mM。
(1.3)加入10微升p H7.3的1M甘氨酸缓冲液，室温混悬反应10分钟，终止活化反应。
(1.4)磁分离10分钟，去上清，磁珠用偶联缓冲液洗涤3次，每次用量5ml。
(1.5)活化后磁珠用0.5m l偶联缓冲液重悬后4℃保存备用(12小时内用于偶联有效)。
(2)抗体分子的活化：在抗体分子表面生成巯基。活化方法包括：
(2.1)取3m g抗体装入透析袋，4℃条件下用蛋白活化缓冲液透析超过12小时，缓冲液用量要大于500m
l。透析后抗体用紫外分光光度法测量浓度，浓度应大于5m g/m l否则需浓缩调整。
(2.2)取2mg透析后抗体，加入活化剂2-Iminothiolane·HCl(2IT)室温反应30分钟，活化剂反应浓度为0.15mg/ml。
(2.3)按体积比1∶100比例加入p H7.3的1M甘氨酸溶液，室温反应5分钟终止反应。
(2.4)用S e p h a d e x G25谱柱纯化活化后抗体，所用缓冲液为蛋白活化缓冲液。
(2.5)活化后抗体4℃保存备用，在12小时内用于偶联有效。
(3)偶联：将抗体分子共价结合在磁珠表面，偶联方法包括：
(3.1)将活化后磁珠与活化后抗体混合，室温混悬条件下反应12～16小时。
(3.2)磁分离10分钟，将上清溶液小心移出后保存与4℃，用于偶联效率检测。
(3.3)磁珠用磁珠保存缓冲液洗涤3次，每次用5ml。用磁珠保存液将磁珠稀释到10mg/ml，室温充分振荡混悬1小时后保存于4℃。
(4)测定偶联效率：用紫外分光光度法测定磁珠偶联后上清溶液内抗体浓度，计算未结合抗体质量。用
参与偶联的抗体总质量减去未结合抗体质量再除以抗体总量即为抗体偶联率。
(5)磁珠偶联效果检测：检测偶联后磁珠的活性。方法包括：
(5.1)用碱性磷酸酶(ALP)标记的小鼠单克隆抗体为指示剂，并稀释到已知的工作浓度如0.1μg/ml。
(5.2)用磁珠保存缓冲液将偶联后磁珠(浓度10m g/m l)倍比稀释，相应浓度为10m g/m l、5m g/m l、2.5mg/ml、1.25mg/ml等。
(5.3)将稀释后磁珠30μl与酶标抗体溶液30μl混合，混匀后37℃温育10分钟。
(5.4)磁分离去上清，磁珠洗涤3次，每次用300μl。
(5.5)加入A L P催化显底物单磷酸酚酞(P M P)90μl，37℃温育15m i n后加300μl 0.2M N a O H 终止反应。磁分离，测量上清550纳米下吸光度值(OD550)。
(5.6)当磁珠浓度处于较高浓度时吸光度值基本保持一致，但当低于某一浓度时吸光度值会出现明显
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