(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611122398.1
(22)申请日 2016.12.08
(71)申请人 山西大学
地址 030006 山西省太原市小店区坞城路
92号
(72)发明人 张姝 郝爱静 张永杰
(74)专利代理机构 山西五维专利事务所(有限
公司) 14105
代理人 张福增
(51)Int.Cl.
C12N 15/10(2006.01)
(54)发明名称
法
(57)摘要
一种适于高AT含量DNA的PCR扩增体系，按每
25μL PCR扩增体系含有：DNA聚合酶0.5U，10×
PCR buffer 2.5μL，dNTPs 2.5μL，上游引物
0.5μL，下游引物0.5μL，DNA溶液0.5μL，MgCl 2
1.5～7mM，ddH 2O余量。本发明所述PCR扩增技术 可扩增AT含量超过72％、长度高达5.4kb的DNA片
段，可以成功扩增不同复杂程度的基因，并且操
作步骤少，操作时间短，所需仪器设备简单，能普
遍适用于生物工程类科学研究。
权利要求书1页 说明书8页序列表6页 附图5页CN 106544340 A 2017.03.29
C N 106544340
A
1.一种适于高AT含量DNA的PCR扩增体系，其特征在于，按每25μL PCR扩增体系含有：DNA聚合酶0.5U，10×PCR buffer
2.5μL，dNTPs 2.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，DNA溶液0.5μL，MgCl 2 1.5～7mM，ddH 2O余量。
2.如权利要求1所述的一种适于高AT含量DNA的PCR扩增体系，其特征在于，所述MgCl 2的浓度为1.5～2.5mM。
3.如权利要求1所述的一种适于高AT含量DNA的PCR扩增体系，其特征在于，所述高AT含量基因选自真菌线粒体DNA。
4.如权利要求3所述的一种适于高AT含量DNA的PCR扩增体系，其特征在于，所述真菌线粒体DNA选自Metarhizium robertsii、Metarhizium album或Glarea lozoyensis。
5.如权利要求1所述的一种适于高AT含量DNA的PCR扩增体系，其特征在于，所述高AT含量基因的长度为1.0kb-5.4kb。
6.如权利要求1所述的一种适于高AT含量DNA的PCR扩增体系，其特征在于，所述DNA聚合酶是KOD系列的DNA聚合酶。
7.如权利要求6所述的一种适于高AT含量DNA的PCR扩增体系，其特征在于，所述KOD系列的DNA聚合酶是KOD Plus或KOD Plus Neo。
8.如权利要求1所述的一种适于高AT含量DNA的PCR扩增体系，其特征在于，所述高AT含量基因中AT含量为72-80％。
9.如权利要求1-8任一所述的一种适于高AT含量DNA的PCR扩增体系，其特征在于，所述MgCl 2用MgSO 4替代。
10.一种适于高AT含量DNA的PCR扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备DNA模板，设计上游引物和下游引物，然后按权利要求1制备PCR扩增体系；
(2)PCR扩增，程序为：
①热启动：PCR仪盖温升到105℃，加热模块温度升到94℃后，再将样品放入加热模块，之后开始正常的变性-退火-延伸程序； ②35-40个变性-退火-延伸的循环：
变性：94℃1min；
退火：温度依引物而异，通常比Tm值低3-5℃；时间1min；Tm值相差大于5℃，则再利用较高Tm值的引物计算的退火温度下完成5个循环，然后再利用较低Tm值的引物计算的退火温度下完成剩余的循环；
延伸：72℃；时间依扩增片段的长度而异，1-2kb/min；
③剩余步骤：72℃8min；4℃或12℃保存。
权 利 要 求 书1/1页CN 106544340 A
一种适于高AT含量DNA的PCR扩增体系及方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种适于高AT含量DNA的PCR扩增体系及方法。
背景技术
[0002]PCR技术是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，能将微量的DNA大幅增加。PCR扩增的成功对开展遗传与分子分析是至关重要的，但PCR扩增的效率受很多因素影响，如序列复杂程度、引物质量、酶反应效率、退火温度、循环次数等。PCR技术自诞生30多年来，人们陆续开发和优化了多种PCR相关的试剂，使PCR扩增的成功率大为提高。但是，当遇到特殊DNA模板(如高GC含量、高AT含量)时，扩增困难的情况会经常发生。
[0003]针对高GC含量DNA模板扩增困难的问题，国内外已有许多研究。最常用的解决方案是在PCR体系中加入一定浓度的添加剂，如甜菜碱、二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)、甲酰胺、乙二醇
、1,2-丙二醇、牛血清白蛋白等。添加剂不仅可以提高PCR产物的产量，而且对于提高PCR产物的特异性也有帮助，尤其在扩增较长片段高GC含量DNA模板中的优势非常明显。
[0004]生物体内也存在很多高AT含量的DNA序列，例如线粒体基因组和叶绿体基因组。我们在研究中发现，以这些高AT含量的DNA为模板进行PCR扩增时，经常会出现扩增失败或含有大量非特异性扩增的情况，其中扩增失败更为常见。PCR无效扩增的直接结果就是无法获知其序列，这一情况对诸多基于PCR技术的其他分析技术而言，更是无法继续进行下去。[0005]本发明借鉴高GC含量DNA模板PCR扩增的解决方法，设计优化适于高AT含量DNA模板PCR扩增的体系和方法。
发明内容
[0006]本发明的目的是提供一种能够从高AT含量的DNA模板中稳定获得扩增产物的体系及方法。
[0007]为达到上述目的，本发明提供的技术方案是：
[0008]一种适于高AT含量DNA的PCR扩增体系，包括DNA聚合酶、10×PCR buffer、dNTPs、上游引物、下游引物、DNA模板、ddH2O、MgCl2(25mM)；其中：按每25μL PCR扩增体系含有：DNA 聚合酶0.5U，10×PCR buffer 2.5μL，dNTPs 2.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，DNA溶液0.5μL，MgCl2 1.0～7mM，ddH2O余量。
[0009]上述技术方案中：
[0010]所述MgCl2的浓度优选1.5～2.5mM；
[0011]所述高AT含量基因选自真核生物线粒体DNA或植物叶绿体DNA等，所述真核生物线粒体DNA选自真菌线粒体DNA：如Metarhizium robertsii(罗伯茨绿僵菌，简称MAA)、Metarhizium album(白绿僵菌，简称MAM)和Glarea lozoyensis(抗真菌药物卡泊芬净的产生菌，简称GL)等。
[0012]所述高AT含量基因的长度从1.0kb到5.4kb，在5.4kb的片段中包含有3个内含子区(内含子总长度达到3.3kb，各自编码不同的内含子蛋白)。
[0013]所选用的DNA聚合酶是KOD系列的DNA聚合酶，如KOD Plus、KOD Plus Neo等。[0014]所述MgCl2可以用MgSO4替代；
[0015]所述高AT含量基因中AT含量为72-80％。
[0016]本发明同时保护应用上述PCR扩增体系进行高AT含量基因的PCR扩增的方法，所述PCR扩增的方法包括以下步骤：
[0017](1)PCR扩增体系的准备：制备DNA模板，设计上游引物和下游引物，然后制备上述PCR扩增体系；
[0018](2)PCR扩增程序：
[0019]①热启动：PCR仪盖温升到105℃，加热模块温度升到94℃后，再将样品放入加热模块，之后开始正常的变性-退火-延伸程序；
[0020]②35-40个变性-退火-延伸的循环：
[0021]变性：94℃1min；
[0022]退火：温度依引物而异，通常比Tm值低3-5℃；时间1min；两个引物的Tm值相差如果大于5℃，则在利用较高Tm值的引物计算的退火温度下完成5个循环，然后在利用较低Tm值的引物计算的退火温度下完成剩余的循环。
[0023]延伸：72℃；时间依扩增片段的长度而异，1-2kb/min；
[0024]③剩余步骤：72℃8min；4℃或12℃保存。
[0025]上述技术方案中，使用的是美国伯乐公司的T100PCR仪，但在其它型号的PCR仪上也可实现。
[0026]与现有技术相比本发明具有下列优点：
[0027](1)由于本发明中所述PCR扩增体系的应用，同时结合了热启动，因此，本发明所述PCR扩增技术可扩增AT含量超过72％、长度高达5.4kb的DNA片段。
[0028](2)本发明所述的添加剂是容易得到且价格低廉的化学物质，为大规模实验带来了便利。
[0029](3)扩增产物的特异性高。本发明所述的PCR扩增技术的扩增产物特异性极高，针对不同的模板均可得到单一性目的条带。
[0030](4)本发明对DNA聚合酶要求较低。在测试的4种KOD系列的聚合酶中，使用较低端、较便宜的KOD Plus和KOD Plus Neo即可实现本发明所描述的内容。
[0031](5)仪器设备要求低。本发明所述的PCR扩增技术普遍适用于各种PCR仪，对仪器设备无特殊要求。
附图说明
[0032]图1添加不同浓度的镁离子对扩增MAA-nad5-cob片段的影响，其中：所用的DNAMarker(M)均为Trans2K Plus，其条带从上到下依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp。
[0033]图2添加不同浓度的镁离子对扩增GL-locus3片段的影响
[0034]图3添加不同浓度的镁离子对扩增MAM-rpb3片段的影响
[0035]图4添加不同浓度的镁离子对扩增MAM-cox1-nad1片段的影响
[0036]图5分别添加不同浓度的BSA、DMSO、甲酰胺对扩增片段MAA-nad5-cob的影响，其中：“-”代表无任何添加剂的阴性对照；“+”为添加1.75mM MgCl2的阳性对照。
[0037]图6分别添加不同浓度的BSA、DMSO、甲酰胺对扩增片段GL-locus3的影响，其中：“-”代表无任何添加剂的阴性对照；“+”为添加1.75mM MgCl2的阳性对照。
[0038]图7在1.75mM MgCl2基础上再添加不同浓度的BSA、DMSO、甲酰胺对扩增片段MAA-nad5-cob的影响，其中：“-”代表无任何添加剂的阴性对照；“+”代表仅添加1.75mMMgCl2；其它则在MgCl2基础上还添加了BSA、DMSO或甲酰胺。
[0039]图8在1.75mM MgCl2基础上再添加不同浓度的BSA、DMSO、甲酰胺对扩增片段L-locus3的影响，其中：“-”代表无任何添加剂的阴性对照；“+”代表仅添加1.75mM MgCl2；其它则在MgCl2基础上还添加了BSA、DMSO或甲酰胺。
[0040]图9两种不同的镁盐对扩增片段MAA-nad5-cob与GL-locus3的影响
[0041]图10 4种不同的酶在有(右)或无(左)镁离子存在的情况下扩增片段MAA-nad5-cob的结果
[0042]图11 4种不同的酶在有(右)或无(左)镁离子存在的情况下扩增片段GL-locus3的结果
具体实施方式
[0043]下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
[0044]实施例1：通过添加不同终浓度的MgCl2扩增片段MAA-nad5-cob、GL-Locus3、MAM-rps3和MAM-cox1-nad1
[0045] 1.模板制备
[0046]1)培养菌株：将MAA、GL、MAM从试管斜面接种到新鲜制备的PDA平板中，接种前在培养基表面铺一层无菌的玻璃纸，然后在25℃培养箱中培养1-2周；
[0047]2)收集菌丝体：等菌落长大后，刮取菌丝体于1.5mL离心管中；
[0048]3)充分研磨后，利用CTAB法提取总DNA。
[0049] 2.目的基因扩增
[0050]PCR扩增体系：
[0051]
[0052]PCR扩增程序：
[0053]1)热启动：PCR仪机盖温度升至105℃，样品槽温度升至94℃时，再放入样品；
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