(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010428784.3
(22)申请日 2020.05.20
(71)申请人 北京林业大学
地址 100091 北京市海淀区清华东路35号
(72)发明人 孟冬 曹红燕 付玉杰 杨清
李航航 刘腾跃 杨婉珑
(74)专利代理机构 北京卫平智业专利代理事务
所(普通合伙) 11392
代理人 张新利 谢建玲
(51)Int.Cl.
C12N 15/82(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种农杆菌介导真空侵染木豆
的高效遗传转化方法，属于分子生物学与植物转
基因工程技术领域。本发明的实验步骤主要分为
四个部分：外植体筛选；农杆菌侵染液制备；木豆
全株真空渗透，转基因鉴定。本发明不仅可以获
得由茎部诱导出的稳定转基因根系，且木豆的叶
片部分经过瞬时转染可用于基因表达的快速鉴
定。本发明首次发现木本植物幼苗可通过农杆菌
真空渗透在茎部出转基因根。该方法不仅可以直
接运用于木豆的遗传转化，同时为木本植物的遗
传转化体系提供了新的思路。权利要求书2页 说明书6页 附图3页CN 111876439 A 2020.11.03
C N 111876439
A
1.一种农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：包括：
步骤1、外植体筛选，消毒及无菌培养；
步骤2、农杆菌侵染液的制备；
步骤3、木豆全株真空渗透；
步骤4、叶片与根部鉴定。
2.如权利要求1所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：步骤1外植体筛选，消毒及无菌培养的具体步骤包括：
步骤1.1、木豆选用已有全基因组测序数据的品种“ICPL87119”，木豆种子挑选颗粒饱满匀称，状态健康的种子，以提高出苗率和降低染菌率；
步骤1.2、采用次氯酸钠消毒法对筛选出的木豆种子进行消毒；
步骤1.3、在超净台中将消毒后的木豆种子接种于MS固体培养基中，然后置于人工培养室条件下生长，等待生长20-30天，挑选健壮且生长一致的木豆植株，备用。
3.如权利要求2所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：步骤1.2中具体的消毒过程为：75％酒精消毒30秒，再用次氯酸钠消毒6分钟，最后用无菌水冲洗5次；
步骤1.3中木豆种子消毒后萌发到成苗的阶段都是在人工培养室的组培瓶中进行，保证无菌环境；
待侵染的木豆苗选用培养生长25天木豆苗作为材料的转基因成功率最高。
4.如权利要求2所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：步骤2农杆菌侵染液制备的具体步骤包括：
步骤2.1、将包含有植物过表达载体35S-eGFP-pROK2的农杆菌GV3101于YEP+Rif+Kana 固体培养基上划线接种，置于28℃培养箱倒置培养48h；
步骤2.2、挑单菌落于5mL YEP+Rif+Kana液体培养基中，置于28℃摇床培养12h，转速200rpm；
步骤2.3、将5mL菌液转入150mL YEP+Rif+Kana液体培养基中，置于28℃摇床培养6h，转速200rpm，使OD600吸光值在3-5之间；
步骤2.4、5000rpm离心10分钟，去上清后沉淀重悬于300mL普通MS液体培养基中，使OD600吸光值在0.3-2.4之间，备用。
5.如权利要求4所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：步骤2.1中所述的包含有植物过表达载体35S-eGFP-pROK2的农杆菌GV3101是通过常规GV3101农杆菌冻融法将35S-eGFP-pROK2质粒转入农杆菌GV3101感受态获得的；
YEP+Rif+Kana培养基指具有100mg/L硫酸卡那霉素和500mg/L利福平的YEP培养基。
6.如权利要求4所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：木豆叶片部位瞬时转化测定时，农杆菌侵染液选择OD600＝1.2；木豆根部稳定转化测定时，农杆菌侵染液选择OD600＝2.4。
7.如权利要求4所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：步骤3木豆全株真空渗透的具体步骤包括：
步骤3.1、将状态良好的木豆植株浸没于农杆菌侵染液中，在0.03-0.09MPa真空压力条件下侵染5分钟；
步骤3.2、真空侵染后洗苗，于滤纸上除去表面水分，最后置于含有100mg/L头孢素的MS 培养基中；
步骤3.3、将侵染后的木豆植株置于人工培养室条件下生长10至15天，在茎下部发出新根；
步骤3.4、侵染后的木豆植株在培养3-7天之间取叶片部位用于基因瞬时表达的快速鉴定。
8.如权利要求7所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：
步骤3.1中，木豆根部稳定转化测定时，压力值设定在0.07MPa，木豆叶片部位瞬时转化测定时，压力值设定在0.05MPa；
步骤3.2中所述洗苗是为了除去植物表面在瞬转时残留的农杆菌，具体操作为：先用无菌水洗一次，125mg/L头孢抗性无菌水洗一次，最后无菌水洗三次；
步骤3.4中真空侵染后叶片部位的取样时间在培养5天，此时是木豆苗状态最好且基因表达量最高的时间段。
9.如权利要求7所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：所述的人工培养室条件为温度25±2℃，光照16小时，黑暗8小时的循环周期。
10.如权利要求7所述的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，其特征在于：步骤4叶片与根部鉴定的具体步骤包括：
步骤4.1、取步骤3.4中所述的培养3-7天后的木豆叶片组织冻于液氮中，用CTAB法提取RNA，反转录为cDNA后用荧光定量方法鉴定基因表达量变化；
步骤4.2、将步骤3.3中所述生长10至15天后发出新根的木豆植株截去旧根，置于新的MS培养基中继续生长；或者将步骤3.3中所述生长10至15天后发出新根的木豆全株移栽到育苗土中，等待新根生长茁壮后再除去旧根；
步骤4.3、待新根生长一段时间后，剪取部分分生的侧根冻于液氮中，待DNA检测鉴定；
步骤4.4、将步骤4.3中获得的根部组织用CTAB法提取DNA，用35S+eGFP基因的全长引物进行PCR扩增，若PCR扩增出大小为720bp的目的条带，且测序结果比对为35S+eGFP基因序列，而未侵染的木豆植株根部未能扩增出任何条带，表明茎下部发出的新根为转基因不定根；
步骤4.2中所述新的MS培养基是指添加50mg/L头孢素的MS培养基，且在培养基冷却但未凝固时将剪去旧根的发出新根苗移入。
一种农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法
技术领域
[0001]本发明属于分子生物学与植物转基因技术领域，具体地涉及一种利用农杆菌介导真空侵染木豆植株的高效遗传转化方法及其应用，能够获得稳定转化的转基因根和瞬时转化的叶片。
背景技术
[0002]木豆原产于印度，是世界第六大食用豆类，是半干旱地区主要的经济作物，具有较高的营养价值和药用价值。近年来，随着木豆的药用价值不断被开发，种植范围也不断扩大。以传统方法栽培木豆已经无法满足市场需求，如何通过分子手段培育高产量高质量的木豆成为人们关注的问题，同时相关的科学研究也在不断展开。然而相比于水稻，玉米，大豆等草本植物，木豆作为木本植物，要通过
组织细胞的遗传转化方法一直都是基因工程中的难点。目前关于木豆遗传转化方法的报道极少，本发明主要借鉴了大豆等相近物种的遗传转化方法。在此前，有利用发根农杆菌K599介导真空渗透大豆种子下胚轴而获得转基因毛状根的遗传转化方法。但该方法存在转化根和正常根同时存在，不好区分的问题。而本发明不仅可以在木本植物中获得转化根，同时可以排除原始根的干扰。本发明的优势还在于无菌条件下高效快速的获得大量转基因根组织，以及保留复合体转基因木豆植株。该方法是用农杆菌侵染木豆全株，因此地上部分的基因瞬时表达可以应用于基因功能的快速验证。
发明内容
[0003]本发明的目的在于提供一种高效、快速、稳定的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，通过木豆种子筛选，无菌培养长成茁壮木豆苗后，取木豆全株浸没于农杆菌侵染液中，在压力条件下进行真空侵染；侵染过后洗苗移栽到新的抗性MS培养基中培养，等待在茎部长出新根；待出新根后剪去旧根，洗苗移栽至新的MS培养基等待转基因新根生长；或待长出新根后直接全株移栽至育苗土中，等待新根生长茁壮后再截去旧根。与此同时，运用相同的真空侵染方法后培养3-7天的木豆苗的叶片可用于基因表达量的验证。同时该方法的优点还包括操作步骤简单，并能够获得无菌的转基因材料，解决木豆遗传转化周期长，效率低等问题，该方法可以跳过愈伤再生等步骤，直接由茎部获得转基因根系，同时地上部分可用于基因瞬时表达的快速验证。
[0004]为实现上述目的，改善目前木豆遗传转化技术的薄弱现状，本发明所采取的技术方案具体如下：
[0005]一种农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，包括：
[0006]步骤1、外植体筛选，消毒及无菌培养；
[0007]步骤2、农杆菌侵染液的制备；
[0008]步骤3、木豆全株真空渗透；
[0009]步骤4、叶片与根部鉴定。
[0010]在上述方案的基础上，步骤1外植体筛选，消毒及无菌培养的具体步骤包括：[0011]步骤1.1、木豆选用已有全基因组测序数据的品种“ICPL87119”，木豆种子挑选颗粒饱满匀称，状态健康的种子，以提高出苗率和降低染菌率；
[0012]步骤1.2、采用次氯酸钠消毒法对筛选出的木豆种子进行消毒；
[0013]步骤1.3、在超净台中将消毒后的木豆种子接种于MS固体培养基中，然后置于人工培养室条件下生长，等待生长20-30天，挑选健壮且生长一致(株高相近，具有5片叶片的时期)的木豆植株，备用。
[0014]在上述方案的基础上，步骤1.2中具体的消毒过程为：75％酒精消毒30秒，再用次氯酸钠消毒6分钟，最后用无菌水冲洗5次。
[0015]在上述方案的基础上，步骤1.3中木豆种子消毒后萌发到成苗的阶段都是在人工培养室的组培瓶中进行，保证无菌环境；
[0016]待侵染的木豆苗选用培养生长20-30天的苗，其中以25天木豆苗作为材料的转基因成功率最高。
[0017]在上述方案的基础上，步骤2农杆菌侵染液制备的具体步骤包括：
[0018]步骤2.1、将包含有植物过表达载体35S-eGFP-pROK2的农杆菌GV3101于YEP+Rif+ Kana固体培养基上划线接种，置于28℃培养箱倒置培养48h；
[0019]步骤2.2、挑单菌落于5mL YEP+Rif+Kana液体培养基中，置于28℃摇床培养12h，转速200rpm；
[0020]步骤2.3、将5mL菌液转入150mL YEP+Rif+Kana液体培养基中，置于28℃摇床培养6h，转速200rpm，使OD600吸光值在3-5之间；
[0021]步骤2.4、5000rpm离心10分钟，去上清后沉淀重悬于300mL普通MS液体培养基(PH5.8)中，使OD600吸光值在0.3-2.4之间，备用。
[0022]在上述方案的基础上，步骤2.1中所述的包含有植物过表达载体35S-eGFP-pROK2的农杆菌GV3101是通过常规GV3101农杆菌冻融法将35S-eGFP-pROK2质粒转入农杆菌GV3101感受态获得的。
[0023]在上述方案的基础上，YEP+Rif+Kana培养基指具有100mg/L硫酸卡那霉素和500mg/L利福平的YEP培养基。
[0024]在上述方案的基础上，农杆菌侵染液是选择OD600在0.3-2.4之间的侵染液，其中以OD600在2.4的侵染液侵染后的根部转基因效率高，以OD600在1.2的侵染液侵染后的叶片转化效率高；且侵染液以MS培养基为基础，既不影响农杆菌侵染活性，又可降低木豆侵染后的伤害程度。
[0025]在上述方案的基础上，步骤3木豆全株真空渗透的具体步骤包括：
[0026]步骤3.1、将状态良好的木豆植株浸没于农杆菌侵染液中，在0.03-0.09MPa真空压力条件下侵染5分钟；
[0027]步骤3.2、真空侵染后洗苗，于滤纸上除去表面水分，最后置于含有100mg/L头孢素的MS培养基中；
[0028]步骤3.3、将侵染后的木豆植株置于人工培养室条件下生长10至15天，在茎下部发出新根；
[0029]步骤3.4、侵染后的木豆植株可在培养3-7天之间取叶片部位用于基因瞬时表达的
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