(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201880004078.7(22)申请日 2018.06.28
(66)本国优先权数据
201710554315.4 2017.07.02 CN (85)PCT国际申请进入国家阶段日
2019.04.25(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/CN2018/093254 2018.06.28(87)PCT国际申请的公布数据
WO2019/007251 ZH 2019.01.10
(71)申请人 中南大学湘雅医院
地址 410000 湖南省长沙市开福区湘雅路
87号(72)发明人 张灼华 万正卿 凌捷
(74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限
公司 11227
代理人 张柳 赵青朵(51)Int.Cl.
C12Q 1/6888(2018.01)C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
本发明提供一种检测样品中寄生虫来源的DNA的方法，以及利用该检测方法诊断宿主对象是否正经受寄生虫感染的方法，确定寄生虫感染功效的方法，以及筛选寄生虫感染候选的方法，
还提供用于上述方法的试剂盒。
CN 109890985 A 2019.06.14
C N 109890985
A
(12)按照专利合作条约所公布的国际申请
(19)世界知识产权组织
国际局
(10)国际公布号
(43)国际公布日
W O2019/007251A1 2019年1月10日（10.01.2019)P C T
(51)国际专利分类号：NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW)，欧亚（AM，
C12Q1/68(2.01)C12N15/11(2006.01)AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM)，欧洲(AL,AT,BE,B G (21)国际申请号PCT/CN2018/093254CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,H U
IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT (22)国际申请日2018年6月28日（28.06.2018)
RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OAPI(BF,BJ,CF,CG,C L
(25)申请语中文CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG)。
(26)公布语言：中文本国际公布：
(30)优先权：-包括国际检索报告(条约第21条(3))。
-包括说明书序列表部分(细则5.2(a))。
201710554315.42017年7月2日（02.07.2017)C N
(71)申请人：中南大学湘雅医院（XIANGYA
HOSPITAL CENTRAL SOUTH UNIVERSITY)[CN/
CN]；中国湖南省长沙市开福区湘雅路
87号，Hunan410000(CN)。
(72)发明人：张灼华(ZHANG,Zhuohua)；中国湖南省
长沙市开福区湘雅路87号，Hunan410008(CN)…
万正卿(WAN,Zhengqing)；中国湖南省长沙市
开福区湘雅路87号，Himan410008(CN)…凌
捷(LING,Jie)；中国湖南省长沙市开福区湘
雅路87号，Hunan410008(CN)…
(74)代理人：北京集佳知识产权代理有限公司
(UNITALEN ATTORNEYS A T LAW)；中国北京
市朝阳区建国门外大街22号赛特广场
7层，Beijing100004(CN)…
(81)指定国（除另有指明，要求每一种可提供的国家
保护）：AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,
BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,
CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,
GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,
JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,
LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,
MY,ML,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,
PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,
SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,
US,UZ,VC,VN,ZA,ZM,Z W。
(84)指定国（除另有指明，要求每一种可提供的地区
保护）：ARIPO(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,
(54)Title:METHOD FOR DETECTING PARASITIC INFECTION AND KIT
(54)发明名称：检测寄生虫感染的方法和试剂盒
(57)Abstract:The present invention provides a method for testing the DNA of the source of the parasite i n a sample,a method for diagnosing,using the testing method,whether a host object i s suffered with a parasitic infection,a method for determining a treatment effect on a parasitic infection,and a method for screening a candidate treatment o f a parasitic infection.Also provided i s a kit for the methods.
(57)摘要：本发明提供一种检测样品中寄生虫来源的DNA的方法，以及利用该检测方法诊断宿主对象是否正经受寄生虫感染的方法，确定寄生虫感染功效的方法，以及筛选寄生虫感染候选的方法，还提供用于上述方法的试剂盒。
检测寄生虫感染的方法和试剂盒
本申请要求于2017年07月02日提交中国专利局、申请号为CN 201710554315.4、发明名称为"检测寄生虫感染的方法和试剂盒"的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
[01]本发明涉及寄生虫感染的检测，具体地涉及通过检测受试者体液(如血液）中寄生虫游离DNA来确定所述寄生虫感染状态。本发明还涉及用于这种检测的试剂盒及其用于检测寄生虫感染的用途。
背景技术
[02]寄生虫病是寄生虫侵入人体而引起的疾病。因虫种和寄生部位不同，引起的病理变化和临床表现各异。本类疾病分布广泛，世界各地均可见到，尤以热带和亚热带地区更多。寄生虫感染经常是无症状的或者至少在感染早期是无症状的。为了早期确定人体是否感染寄生虫以及时介入，需要有效的早期检测手段。
[03]包虫病，又名棘球场病，是一种严重的人畜共患性寄生虫病。包虫病主要有两种类型，即细粒棘球绦虫感染所致的嚢型包虫病和多房棘球绦虫感染所致的泡型包虫病。对于泡型包虫病，棘球坳呈多个泡散布于宿主组织中且嚢泡壁很薄，难以干净彻底地手术去除，因此泡型包虫病又被称为虫癌。棘球坳主要寄生部位为肝脏，亦可寄生于肺部及脑部等组织。其致病作用主要表现在机械性压迫、毒素作用和过敏反应等几个方面，疾病晚期在寄生部位形成巨大嚢肿，压迫周围正常组织，造成不可逆转的损害。近年来随着旅游业的发展、人口的流动和家犬的急剧增多，包虫病已成为世界流行性疾病，严重危害世界公共卫生和经济发展。在我国，包虫病主要在西藏、新疆、青海、四川、内蒙古等西部省份流行，随着国家"一带一路"计划的实施，包虫病的防治工作日益受到重视，建立新的有效的筛查和诊断手段刻不容
緩。
[04]现有包虫病的诊断是根据流行病学史、临床表现、影像学特征、组织活检和实验室检查（主要是血清免疫学检查）的结果进行综合诊断。
[05]影像学检查可以直观地观察到感染形成的嚢或泡，能较好地支持临床诊断，为当前诊断包虫病的首选方法。然而，影像学检查易受局部组织情况影响，有时难以明确判断，对仪器设备要求较高，不适于筛查。
[06]病原学检查（组织活检）是包虫病检测的"金标准"，能直接看到虫体，具有确诊意义。但是病原学检查取样困难，直接穿刺可能导致棘球坳从破裂的嚢泡中扩散到腹腔中。
[07]然而，影像学检查和病原学检查均需要在形成显著嚢泡以后才能进行，难以在临床症状出现之前早期发现包虫病感染。
[08]免疫学检查方法可早于临床表现及影像学检查发现包虫病。目前常用的免疫学检测包括酶联免疫吸附试验（ELISA)、间接血凝试验(IHA)、补体结合试验（CFT)和间接荧光抗体试验（IFA)等。这些方法在检测包虫病上各有优劣，但主要缺点是均存在非特异反应及交叉免疫，有一定的假阳性率；并且难以与既往感染区分，因而不适用于病情实时监测。
[09]中国专利申请公开CN103374615A披露了一种检测犬嚢性包虫病的PCR检测试剂盒，通过PCR扩增以检测受检动物粪便中含有的细粒棘球绦虫的12S rDNA来确定其是否感染包虫病。类似地，中国专利申请公开CN105018613A和CN105925724A分别披露了PCR扩增检测受试动物如狐狸粪便中的棘球绦虫特异性DNA来确定受试动物是否感染包虫病的方法。犬类等动物是棘球绦虫的最终宿主，其肠道中也有成虫，粪便中有大量虫卵。可惜的是，人是棘球绦虫的中间宿主，肠道中无成虫，粪便中也无虫卵，因此这些方法无法适用于人。
[10]寄生虫病（如包虫病）患者往往由于缺乏有效的筛查和诊断手段，错过了最佳时机。仍然需要
更有效地早期检测寄生虫病感染的方法，以及时发现寄生虫感染并尽早实施性介入。
发明内容
[11]发明人意外地发现，感染寄生虫（如棘球坳）的宿主体液（如血液、唾液、尿液）中存在源自寄生虫（如棘球坳）的游离DNA。通过本发明方法选择性富集和特异性检测宿主体液中这些寄生虫来源的游离DNA，可以判断宿主是否存在寄生虫感染。即便是在未发现临床症状之前，感染寄生虫的宿主体液中也能通过本发明方法检测到宿主体液中寄生虫来源的游离DNA。因此，可以在感染早期就发现寄生虫感染，进而指导针对寄生虫感染实施性介入；而且可以监测寄生虫病的效果。从而在这些工作的基础上完成了本发明。[12]在一个方面中，本发明提供一种检测样品中寄生虫来源的DNA 的方法，其包括
1)提取样品中的DNA;
2)选择性富集步骤1)所得样品DNA中的寄生虫来源的DNA;
3)将步骤2)经富集的DNA进行高通量测序；和
4)分析步骤3)的测序结果；其中如果测序结果中包含寄生虫来源的DNA序列，则指示所述样品包含寄生虫来源的游离DNA。[13]在一个实施方案中，所述样品是体液样品，优选地是血液、唾液和/或尿液
的样品，特别地是血清和/或血浆的样品。所述体液样品可以来自p甫乳动物，例人。
[14]在另一个实施方案中，所述寄生虫选自原虫、线虫、吸虫和绦虫，具体地选自钩虫、蛔虫、血吸虫、绦虫、蛲虫、弓形虫、阿米巴原虫，更具体地是绦虫，例如棘球绦虫，例如是细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫。
[15]在另一个实施方案中，在步骤2)选择性富集中使用不参与富集性扩增过程也不影响富集性扩增过程的独立DNA，作为对不同样品进行均一化比较的参照；所述独立DNA例如是λ噬菌体基因组DNA，还可以考虑使用样品中人基因组DNA作为均一化比较的参照。[16]在第二个方面中，本发明提供一种诊断宿主对象是否正经受寄生
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