(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011284911.3
(22)申请日 2020.11.17
(71)申请人 招远新兴化工有限公司
地址 265400 山东省烟台市招远市金岭镇
上华山
申请人 河北一然生物科技有限公司
(72)发明人 赵林森 路江浩 贾晓蒙 高景伟
杨玲 赵星 贾洪利 郭润晴
张士成
(74)专利代理机构 北京睿博行远知识产权代理
有限公司 11297
代理人 龚家骅
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
C12N 1/04(2006.01)
A23L 33/135(2016.01)A23L 29/00(2016.01)A23P 10/30(2016.01)A23L 33/105(2016.01)A23L 33/10(2016.01)A23L 11/00(2016.01)A61K 35/747(2015.01)A61K 36/899(2006.01)A61K 9/19(2006.01)A61K 47/12(2006.01)A61K 47/10(2006.01)A61K 9/50(2006.01)A61P 37/04(2006.01)A61P 1/00(2006.01)C12R 1/25(2006.01) (54)发明名称
制剂及应用
(57)摘要
本发明提供一种植物乳杆菌活菌制剂及其
中所用冷冻干燥保护剂包括甘油1‑3wt%、10‑羟
基‑2‑癸烯酸0.05‑0.15wt%，10‑羟基‑2‑癸烯酸
与甘油质量比为1:15‑20。本发明提供的一种植
物乳杆菌活菌制剂具有生物活性高，能够增强机
体免疫功能、高效且持久调整肠道菌平衡的优
点。权利要求书1页 说明书11页 附图6页CN 112094790 A 2020.12.18
C N 112094790
A
1.一种植物乳杆菌冻干菌粉的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
a、将植物乳杆菌LP45发酵培养后离心收集菌体；
b、用冷冻干燥保护剂与菌体混合均匀，得到菌悬液；
c、将菌悬液倒入冻干瓶，瓶口密封，在-40至-80℃预冻10-14h，再置于真空冷冻干燥机中-40至-50℃条件下干燥14-20h，得到所述植物乳杆菌冻干菌粉；
所述冷冻干燥保护剂包括甘油1-3wt%、10-羟基-2-癸烯酸0.05-0.15wt%，10-羟基-2-癸烯酸与甘油的质量比为1:15-20。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥保护剂中还包括脱脂乳粉10-15wt%、海藻糖5-10wt%、蔗糖3-8wt%、明胶1-3wt%、谷氨酸钠0.05-2wt%、L -半胱氨酸0.05-1wt%和硫酸锰0.3-0.5wt%。
3.一种植物乳杆菌冻干菌粉，其特征在于：采用权利要求1-2任一项中所述的方法进行制备。
4.一种冻干植物乳杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
S1、单层微胶囊的制备：将培养的植物乳杆菌LP45发酵液离心收集菌体，将收集的菌体与冷冻干燥保护剂混合均匀，加入3wt%海藻酸钠溶液混合均匀后，加入碳酸钙溶液混合均匀，加入含有1.5%体积
分数的吐温80的大豆油，400-500r/min搅拌乳化12-18min，加入含有0.5%体积分数的冰醋酸的大豆油，400-500r/min搅拌20-25min，向搅拌后的混合溶液中加入醋酸盐溶液，静置1.5-2h，离心收集微胶囊，用生理盐水重复洗涤3-5次，得到单层微胶囊；
S2、二次包衣的制备：将得到的单层微胶囊置于质量体积分数为0.2%的壳聚糖溶液中，100-150r/min搅拌15-20min，静置40-60min，过滤收集微胶囊，得到植物乳杆菌微胶囊；
S3、冷冻干燥：将制得的植物乳杆菌微胶囊经过预冻后进行真空冷冻干燥，得到冻干植物乳杆菌微胶囊；
所述步骤S1中冷冻干燥保护剂包括：脱脂乳粉10-15wt%、海藻糖5-10wt%、蔗糖3-8wt%、甘油1-3wt%、10-羟基-2-癸烯酸0.05-0.15wt%、明胶1-3wt%、谷氨酸钠0.05-2wt%、L -半胱氨酸0.05-1wt%和硫酸锰0.3-0.5wt%，所述10-羟基-2-癸烯酸与甘油质量比为1:15-20。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述菌体与冷冻干燥保护剂的质量体积比为1:2-4。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述海藻酸钠和碳酸钙的质量比为2-5:1。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述菌体与海藻酸钠溶液的质量比为1:2.5-3.5。
8.一种冻干植物乳杆菌微胶囊，其特征在于：采用权利要求4-7任一项中所述的方法进行制备。
9.权利要求3所述的一种植物乳杆菌冻干菌粉在制备调理胃肠道的药品或食品中的用途。
10.权利要求8所述的一种冻干植物乳杆菌微胶囊在制备调理胃肠道的药品或食品中的用途。
权 利 要 求 书1/1页CN 112094790 A
一种调节肠道菌的植物乳杆菌LP45活菌制剂及应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种调节肠道菌的植物乳杆菌LP45活菌制剂及应用。
背景技术
[0002]植物乳杆菌(L plantarum)属于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性菌，兼性厌氧，是人体胃肠道的益生菌，代谢可以产生有机、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种天然抑菌物质，调整菌之间的关系，维持和保证菌最佳优势组合以及组合的稳定，阻止了致病菌的定殖与入侵，拮抗致病菌和有害微生物的生长及毒素的黏附，具有维持肠道菌平衡的作用。但是乳酸菌较难长期保存，因此，乳酸菌的保藏成了热门的研究课题。利用真空冷冻干燥技术生产活菌制剂是多种保藏方法中较为理想的一种。而制作菌粉的关键是保护剂种类及配比的选择。因此，选择一种使用便捷的保藏形式，以及研究使菌种存活率高的保护剂配方有着积极意义。
[0003]乳酸菌的长期保藏方法，多采用冷冻干燥法或喷雾干燥法，将乳酸菌制成粉剂，用以延长保存时间。冷冻干燥是将欲保藏的微生物细胞悬浮液冻结后，在真空条件下使冰升华，最后达到干燥的目的。此方法主要是根据微生物生理、生化特点，干燥后使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受到抑制，达到休眠状态，以保持菌株原有特性。而且用这种方法生产的发酵剂与喷雾干燥法等其他方法生产的发酵剂相比具有更高的稳定性、活性。但真空冷冻干燥过程是使发酵液中的游离水在冻结状态下失去的一个过程，冷冻和干燥两个过程会造成部分微生物细胞的损伤、死亡及某些酶蛋白分子的钝化，如果冻干工艺中保护剂选择不当，就会使乳酸菌的存活率下降。发酵液干燥前后乳酸菌的存活率大小可直接体现不同保护剂对乳酸菌活力的影响。因此，冻干保护剂是制作干燥发酵剂最为关键的因素之一，它不仅影响发酵剂在冻干过程中的细胞存活率，也影响保藏期间的细胞稳定性。[0004]现有技术如公开号为CN 103695330 A的中国发明专利，公开了一种植物乳杆菌活菌制剂的制备方法，是将植物乳杆菌培养至稳定期后加入经过破壁处理的酿酒酵母，将发酵液离心得到菌泥，菌泥中混入保护剂进行真空干燥，将真空干燥得到的植物乳杆菌菌粉与低聚糖混合。本发明的方法简便、成本低，实现了废物资源化，适合工业化生产。
发明内容
[0005]本发明的目的在于提供一种生物活性高，能够增强机体免疫功能、高效且持久调整肠道菌平衡的一种调节肠道菌的植物乳杆菌LP45活菌制剂及应用。
[0006]本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
提供一种植物乳杆菌冻干菌粉的制备方法，具体包括以下步骤：
a、将植物乳杆菌LP45发酵培养后离心收集菌体；
b、用冷冻干燥保护剂与菌体混合均匀，得到菌悬液；
c、将菌悬液倒入冻干瓶，瓶口密封，在-40至-80℃预冻10-14h，再置于真空冷冻干燥机
中-40至-50℃条件下干燥14-20h，得到所述植物乳杆菌冻干菌粉；
上述冷冻干燥保护剂包括甘油1-3wt%、10-羟基-2-癸烯酸0.05-0.15wt%，10-羟基-2-癸烯酸与甘油质量比为1:15-20。10-羟基-2-癸烯酸与甘油质量比为1:15-20时，可能通过增强甘油对水的结晶过程的弱化，更好的保护细胞免受损伤，能够有效提高菌体在冻干过程中的活菌存活率，有利于植物乳杆菌在胃肠道中定植，提高对人体的保健作用。[0007]优选地，上述冷冻干燥保护剂中还包括脱脂乳粉10-15wt%、海藻糖5-10wt%、蔗糖3-8wt%、明胶1-3wt%、谷氨酸钠0.05-2wt%、L-半胱氨酸0.05-1wt%和硫酸锰0.3-0.5wt%。[0008]提供一种植物乳杆菌冻干菌粉，采用上述一种植物乳杆菌冻干菌粉的制备方法进行制备。
[0009]提供一种冻干植物乳杆菌微胶囊的制备方法，具体步骤包括：
S1、单层微胶囊的制备：将培养的植物乳杆菌LP45发酵液离心收集菌体，将收集的菌体与冷冻干燥保护剂混合均匀，加入3wt%海藻酸钠溶液混合均匀后，加入碳酸钙溶液混合均匀，加入含有1.5%体积分数的吐温80的大豆油，400-500r/min搅拌乳化12-18min，加入含有0.5%体积分数的冰醋酸的大豆油，400-500r/min搅拌20-25min，向搅拌后的混合溶液中加入醋酸盐溶液，静置1.5-2h，离心收集微胶囊，用生理盐水重复洗涤3-5次，得到单层微胶囊；
S2、二次包衣的制备：将得到的单层微胶囊置于质量体积分数为0.2%的壳聚糖溶液中，100-150r/min搅拌15-20min，静置40-60min，过滤收集微胶囊，得到植物乳杆菌微胶囊；
S3、冷冻干燥：将制得的植物乳杆菌微胶囊经过预冻后进行真空冷冻干燥，得到冻干植物乳杆菌微胶囊；
上述步骤S1中冷冻干燥保护剂包括：脱脂乳粉10-15wt%、海藻糖5-10wt%、蔗糖3-8wt%、甘油1-3wt%、10-羟基-2-癸烯酸0.05-0.15wt%、明胶1-3wt%、谷氨酸钠0.05-2wt%、L-半胱氨酸0.05-1wt%和硫酸锰0.3-0.5wt%，上述10-羟基-2-癸烯酸与甘油质量比为1:15-20。本发明采用微胶囊技术将植物乳杆菌包裹起来，既能使植物乳杆菌顺利通过胆盐、胃酸环境，又因其良好的溶解性可以将植物乳杆菌及时在肠道内释放定植，从而促进植物乳杆菌对人体保健作用的发挥。10-羟基-2-癸烯酸与甘油质量比为1:15-20时，可能通过增强甘油对水的结晶过程的弱化，更好地保护细胞免受损伤及避免冰晶的形
成对微胶囊造成的机械损伤，能够提高包埋率和对胃液的耐受力，更好地在肠道中定植，进而提高机体的体液免疫能力，刺激上调抗炎因子的表达，抑制促炎因子的分泌，发挥特异性免疫功能，活化肠粘膜的淋巴细胞，刺激SIgA的分泌，提高肠道粘膜免疫功能，有利于调整肠道菌平衡。本发明所制得的冻干植物乳杆菌微胶囊的包埋率可达78.3%以上，活菌数可达到7.5×1011CFU/g以上。[0010]优选地，上述步骤S1中菌体与冷冻干燥保护剂的质量体积比（g/mL）为1:2-4。[0011]优选地，上述步骤S1中海藻酸钠和碳酸钙的质量比为2-5:1。
[0012]优选地，上述步骤S1中菌体与海藻酸钠溶液的质量比为1:2.5-3.5。
[0013]优选地，上述步骤S1中碳酸钙与冰醋酸的摩尔比为1:2.5-3。冰醋酸的含量对于益生菌微胶囊的特性有着显著影响，冰醋酸通过影响碳酸钙中钙离子的溶出从而影响海藻酸钙微胶球的性质。
[0014]优选地，上述步骤S1中将收集的菌体与冷冻干燥保护剂混合前，先与添加剂溶液进行混合。更为优选地，上述添加剂溶液中包括：4-7wt%的菊粉、1-2wt%的燕麦草提取物（含
60wt%燕麦β-葡聚糖）和1-4wt%的熟鹰嘴豆粉。进一步地，上述燕麦草提取物和熟鹰嘴豆粉的质量比为1:1.2-1.8。燕麦草提取物和鹰嘴豆质量比为1:1.2-1.8时能够协同促进植物乳杆菌生成有机酸，抑制肠道中有害细菌的生长，调整肠道菌平衡，同时促进氨的消耗减少氨的产生，降低肠道中氨的含量，修复受损的肠道粘膜，进一步调整肠道菌平衡。[0015]优选地，上述步骤S1中添加剂溶液、冷
冻干燥保护剂、3wt%海藻酸钠溶液和碳酸钙溶液的体积总和与大豆油的总体积比为1:2-5。水油体积比通过影响制得的益生菌微胶囊的粒径影响微胶囊中混合菌体的包埋率和益生菌活菌数。
[0016]优选地，上述步骤S2中单层微胶囊与壳聚糖溶液的质量体积比（g/mL）为1:6-8。[0017]提供一种冻干植物乳杆菌微胶囊，采用上述一种冻干植物乳杆菌微胶囊的制备方法进行制备。
[0018]提供上述一种植物乳杆菌冻干菌粉在制备调理胃肠道的药品或食品中的用途。[0019]提供上述一种冻干植物乳杆菌微胶囊在制备调理胃肠道的药品或食品中的用途。[0020]本发明由于在制备植物乳杆菌活菌制剂时采用了10-羟基-2-癸烯酸与甘油质量比为1:15-20的冷冻干燥保护剂，因而具有如下有益效果：可能通过增强甘油对水的结晶过程的弱化，更好的保护细胞免受损伤及避免冰晶的形成对微胶囊造成的机械损伤，能够提高包埋率和对胃液的耐受力，更好地在肠道中定植，进而提高机体的体液免疫能力，刺激上调抗炎因子的表达，抑制促炎因子的分泌，发挥特异性免疫功能，活化肠粘膜的淋巴细胞，刺激SIgA的分泌，提高肠道粘膜免疫功能，有利于调整肠道菌平衡。本发明所制得的冻干植物乳杆菌微胶囊的包埋率可达78.3%以上，活菌数可达到7.5×1011CFU/g以上。
[0021]本发明由于在制备植物乳杆菌活菌制剂时采用了燕麦草提取物和鹰嘴豆，因而具有如下有益效果：燕麦草提取物和鹰嘴豆质量比为1:1.2-1.8时能够协同促进植物乳杆菌生成有机酸，抑制肠道中有害细菌的生长，调整肠道菌平衡，同时促进氨的消耗减少氨的产生，降低肠道中氨的含量，修复受损的肠道粘膜，进一步调整肠道菌平衡。
[0022]因而本发明是一种生物活性高，能够增强机体免疫功能、高效且持久调整肠道菌平衡的一种调节肠道菌的植物乳杆菌LP45活菌制剂及应用。
附图说明
[0023]图1为本发明试验例2中冻干植物乳杆菌微胶囊活菌数和包埋率的测定结果；
图2为本发明试验例2中模拟人工胃液中菌体存活率的测定结果；
图3为本发明试验例2中微胶囊在模拟人工肠液中活菌数的测定结果；
图4为本发明试验例3中IgG、IL-6、IL-10的含量的检测结果；
图5为本发明试验例3中肠粘膜中SIgA含量的检测结果；
图6为本发明试验例3中有机酸含量的测定结果；
图7为本发明试验例3中肠道氨含量的测定结果。
具体实施方式
[0024]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
1、一种植物乳杆菌冻干菌粉的制备方法，包括：
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