(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910432308.6
(22)申请日 2019.05.23
(71)申请人 苏州海苗生物科技有限公司
地址 215400 江苏省苏州市太仓港经济技
术开发区银港路52号
(72)发明人 王文元 谭淼 罗芳
(74)专利代理机构 苏州佳博知识产权代理事务
所(普通合伙) 32342
代理人 唐毅
(51)Int.Cl.
C12N 5/095(2010.01)
(54)发明名称
(57)摘要
养的方法及培养基，其方法步骤包括：第一步：将
细胞瘤组织加入PBS缓冲液；去除血块及坏死细
胞，剪碎至糜状；第二步：加入Accutase溶液，使
组织块消化呈细胞悬液；第三步：加入GC胶质瘤
瘤细胞培养基进行混匀，终止消化；并细胞悬液
经滤网(BD)过滤，获得单细胞悬液；第四步：加入
PBS再次重悬沉淀，洗涤细胞，除去酶溶液；第五
步：加入红细胞裂解液裂解红细胞，弃上清，加入
PBS洗涤细胞沉淀以除去红细胞裂解液；第六步：
各加入NXFS胶质瘤干细胞培养基至Laminin包被
的6孔细胞板进行瘤干细胞原代培养。能够得到
80％左右纯度的胶质瘤干细胞以上。权利要求书2页 说明书9页 附图3页CN 111979197 A 2020.11.24
C N 111979197
A
1.一种胶质瘤干细胞体外分离培养的方法，其特征在于，其步骤包括：
第一步：将新鲜胶质瘤组织置于PBS中，无菌环境下剪切至糜状；
第二步：加入Accutase溶液，使组织块消化至细胞悬液；
第三步：加入GC胶质瘤瘤细胞培养基进行混匀，终止消化；并细胞悬液经滤网过滤，获得单细胞悬液；
第四步：加入PBS再次重悬沉淀，洗涤细胞，除去酶溶液；
第五步：加入红细胞裂解液裂解红细胞，弃上清，加入PBS洗涤细胞沉淀以除去红细胞裂解液；
第六步：各加入NXFS胶质瘤干细胞培养基至Laminin包被的6孔细胞板进行瘤干细胞原代培养；
其中，所述NXFS胶质瘤干细胞培养基的成分包括：Basal Medium、Proliferation Supplement、B-27、EGF、bFGF、Heparin Solution、GlutaMAX-I、Sodium Pyrurate、人胰岛素与Pen Strep。
2.如权利要求1所述的胶质瘤干细胞体外分离培养的方法，其特征在于，所述NXFS胶质瘤干细胞培养基，每配制50mL其成分为：
NeuroCultTM-XF Basal Medium，40-42.3mL；
NeuroCultTM-XF Proliferation Supplement，5-6mL；
B-27(50x Thermofisher#17504-044)，1-2.8mL；
10ug/mL EGF，50uL；
10ug/mL bFGF，50uL；
Heparin Solution(Gibico STEMCELL#07980)，50uL；
GlutaMAX-I(100x,Gibco#35050-061)，0.5-0.7mL；
Sodium Pyrurate(100mM,Gibco#11360-070)，0.3-0.6mL；
人胰岛素，25uL 0.02mg/uL；
Pen Strep，0.5mL。
3.一种NXFS胶质瘤干细胞培养基，其特征在于，所述培养基的成分包括：Basal Medium、Proliferation Supplement、B-27、EGF、bFGF、Heparin Solution、GlutaMAX-I、Sodium Pyrurate、人胰岛素与Pen Strep。
4.如权利要求3所述NXFS胶质瘤干细胞培养基，其特征在于，所述NXFS胶质瘤干细胞培养基，每配制50mL其成分为：
NeuroCultTM-XF Basal Medium，40-42.3mL；
NeuroCultTM-XF Proliferation Supplement，6、5-6mL；
B-27(50x Thermofisher#17504-044)，1-2.8mL；
10ug/mL EGF，50uL；
10ug/mL bFGF，50uL；
Heparin Solution(Gibico STEMCELL#07980)，50uL；
GlutaMAX-I(100x,Gibco#35050-061)，0.5-0.7mL；
Sodium Pyrurate(100mM,Gibco#11360-070)，0.3-0.6mL；
人胰岛素，25uL 0.02mg/uL；
Pen Strep，0.5mL。
一种胶质瘤干细胞体外培养方法、培养基
技术领域
[0001]本发明涉及干细胞培育技术领域，特别涉及一种胶质瘤干细胞体外培养方法及培样基。
背景技术
[0002]恶性胶质瘤是最为常见的颅内恶性肿瘤，约占总体发病人的15％左右，可由脑内健康细胞及初级星型胶质瘤转化而来，多数情况下发病原因不明，且种类较多，按病理可分为星形细胞瘤、髓母细胞瘤、多形胶母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶母细胞瘤等。此类肿瘤没有预防办法，确诊后的一般存活率为12～15个月，目前较为有效的方法为与放化疗结合的手术切除，然而由于此类肿瘤一般为浸润型生长，无明确边界，术后复发率极高，且胶质瘤在个体间高度异质性。
[0003]胶质瘤目前在临床研究上的难点在于：无法进行体内深入研究个体差异较大；胶质瘤细胞目前体外培养的难点在于：取材困难，培养成本巨大，尚无统一可靠的培养规范，培养时间长，难度大。
[0004]通过体外培养病人来源的胶质瘤细胞，建立体外恶性胶质瘤疾病模型，可以从细胞分子角度去深入研究疾病机理，并且可以有针对性的利用此类细胞进行临床前药物筛选及药效评估，无论从研究还是应用都能够实现更高的靶向性，所得结果与通过动物细胞为模型得来相比更为准确。
[0005]例如中国专利申请号第201210299549.6号专利提出一种人脑胶质瘤细胞系，其有揭露胶质瘤的培育过程，但其培养获得胶质瘤的纯度不够。
[0006]因此，有必要提出一种胶质瘤干细胞体外培养方法及培样基液可以深入研究疾病机理。
发明内容
[0007]本发明的目的在于提供具有更高的靶向性的一种胶质瘤干细胞体外培养方法及优化的培样基。
[0008]为实现上述目的，本发明采用的如下技术方案：一种胶质瘤干细胞体外分离培养的方法，其步骤包括：其步骤包括：
[0009]第一步：将新鲜胶质瘤组织置于PBS中，无菌环境下剪切至糜状；
[0010]第二步：加入Accutase溶液，使组织块消化至细胞悬液；
[0011]第三步：加入GC胶质瘤瘤细胞培养基进行混匀，终止消化；并细胞悬液经滤网过滤，获得单细胞悬液；
[0012]第四步：加入PBS再次重悬沉淀，洗涤细胞，除去酶溶液；
[0013]第五步：加入红细胞裂解液裂解红细胞，弃上清，加入PBS洗涤细胞沉淀以除去红细胞裂解液；
[0014]第六步：各加入NXFS胶质瘤干细胞培养基至Laminin包被的6孔细胞板进行瘤干细
胞原代培养；
[0015]其中，一种NXFS胶质瘤干细胞培养基的成分包括：Basal Medium、Proliferation Supplement、B-27、EGF、bFGF、Heparin Solution、GlutaMAX-I、Sodium Pyrurate、人胰岛素与Pen Strep。
[0016]所述NXFS胶质瘤干细胞培养基，每配制50mL其成分为：
[0017]NeuroCultTM-XF Basal Medium，42.3mL；
[0018]NeuroCultTM-XF Proliferation Supplement，5mL；
[0019]B-27(50x Thermofisher#17504-044)，1mL；
[0020]10ug/mL EGF，50uL；
[0021]10ug/mL bFGF，50uL；
[0022]Heparin Solution(Gibico STEMCELL#07980)，50uL；
[0023]GlutaMAX-I(100x,Gibco#35050-061)，0.5mL；
[0024]Sodium Pyrurate(100mM,Gibco#11360-070)，0.5mL；
[0025]人胰岛素，25uL 0.02mg/uL；
[0026]Pen Strep，0.5mL。
[0027]为实现上述目的，本发明采用的如下技术方案：所述培养基的成分包括：Basal Medium、Proliferation Supplement、B-27、EGF、bFGF、Heparin Solution、GlutaMAX-I、Sodium Pyrurate、人胰岛素与Pen Strep。
[0028]如权利要求2所述NXFS胶质瘤干细胞培养基，其特征在于，所述NXFS胶质瘤干细胞培养基，每配制50mL其成分为：
[0029]NeuroCultTM-XF Basal Medium，42.3mL；
[0030]NeuroCultTM-XF Proliferation Supplement，5mL；
[0031]B-27(50x Thermofisher#17504-044)，1mL；
[0032]10ug/mL EGF，50uL；
[0033]10ug/mL bFGF，50uL；
[0034]Heparin Solution(Gibico STEMCELL#07980)，50uL；
[0035]GlutaMAX-I(100x,Gibco#35050-061)，0.5mL；
[0036]Sodium Pyrurate(100mM,Gibco#11360-070)，0.5mL；
[0037]人胰岛素，25uL 0.02mg/uL；
[0038]Pen Strep，0.5mL。
[0039]与现有技术相比，本发明一种胶质瘤干细胞体外培养方法及培养基液的有益效果：能够得到80％左右纯度的胶质瘤干细胞以上，为后期研究避免了杂细胞干扰，能够得到更加有针对性的的研究结果，更具有研究及应用的参考价值。
附图说明
[0040]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
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