实验日期：2017.10.25 实验班级：生物技术 指导教师：张建丽 姓名：高熹 学号：**********
培养基的制作及环境中微生物的分离和纯化
一实验目的
1.熟悉常用微生物培养基的配置、灭菌方法和原理。
2.掌握微生物的分离、纯化。
3.用稀释法分离微生物。
4.认识微生物存在的普遍性，对无菌操作的必要性、何时应该进行有大致理解。
5.培养基的制作。
二实验原理
1.微生物的分离和纯化
土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。从混杂的微生物体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的是平板分离法。为了获得某种微生物的纯培养，一般是供给它适宜的培养条件，或提供抑制其他菌生长而有利于此菌生长的环境。再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌株。 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释成单个细胞，接种培养，一个单菌落代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。
三实验仪器、材料和用具
1.实验材料：
菌源：土样1g
培养基：牛肉膏蛋白胨培养基8个
2.实验仪器:
不同的移液管；培养箱；平皿；涂棒；记号笔；酒精灯；
3.实验试剂:
牛肉膏；蛋白胨；NaCl；蒸馏水；
四实验步骤
（一）配置培养基 （上次课完成，灭菌，实验开始前倒平板）
配方，以1000ml培养基记：
牛肉膏:3.0g
蛋白胨:10.0g
NaCl:5.0g
琼脂:15-25g
水:1000ml
pH:7.4-7.6
（二）周围环境中微生物的检测
在牛肉膏蛋白胨培养基上作如下实验：
1.取一个平板在空气中放置10min。
2.另取一个平板在酒精灯火焰旁放置10min。
（三）从土壤中分离微生物
1．采土样:选择较肥沃土壤（生物系旧馆周围土地）,去表层土,挖5-20cm深度的土壤。取土壤数10g,装入烧杯,带回实验室。
2．制备土壤悬液：称取土样1.0g，放入盛99ml无菌水的三角瓶中，用手振荡5min使土壤均匀分散成为土壤悬液（10-2）。
3．稀释：用移液管从中吸取0.1ml土壤悬液，注入事先分装有0.9ml生理盐水的Ep管中，吹吸3次，摇匀（10-3）。类推制得10-4、10-5的土壤悬液。
4．涂布：用无菌吸头，分别吸取10-3、10-4、10-5浓度土壤稀释液100ul，较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做3个平板。
5．培养：将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于37℃温箱中培养24小时，统计所长出的菌落数。
菌落计数：取出平板，算出统一稀释度三个平板上的菌落平均分布，换算出土样中的菌含量。选择平均菌落数在30~300间的平板。
（四）准备下一次实验的培养基
五实验结果和分析
1.图一的左侧是10-3的照片，可以观察到，实验失败，菌落已经长成了菌苔。2.图一右侧是10-4的照片，实验失败，菌落已长成菌苔。
3.图二左侧是10-5的照片，可以观察到无菌落存在，说明浓度太低，无法长出菌落。
4.图二右侧上方是在空气中放置的照片，可以观察到长出两个菌落，下面是在酒精灯附近放置的照片，无菌落长出。
六实验小结
1.通过对环境中维生物的观察，意识到身边的微生物是很多的，了解了无菌操作的有效性和重要性；同时也认识到周围的微生物也不是想象中那么多，比如空气中不是多满满地悬浮着菌，它的密度其实不是很大的，另外酒精灯旁边是无菌环境。
2.在土壤微生物的检测中，涂板很重要，我们的板中是无法计数的，这给实验结果带来很大影响，推测原因是涂板没有涂开，下次应该涂久一点，看着有液体的地方涂，另外，由图一图二能看出有少量可分辨的菌落，其外观较大，说明可能与培养时间较长有关。
3.参考实验成功的小组的照片：
可以看出已经分出单菌落，可以观察出分离出了46个单菌落。
七思考题1.一般来说，肥沃土壤中细菌，放线菌和霉菌哪种最多？哪种最少？数量级为多少？ 答：土壤中细菌可占土壤微生物总量的70％～90％，其生物量可占土壤重量的1/10000左右。但它们数量大，个体小，与土壤接触的表面积特别大，是土壤中最大的生命活动面，也是土壤中最活跃的生物因素．推动着土壤中的各种物质循环。细菌占土壤有机质的1％左右。土壤中的细菌大多为异养型细菌，少数为自养型细菌。土壤细菌有许多不同的生理类
，如固氮细菌、氨化细菌、纤维分解细菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫酸盐还原细菌、产甲烷细菌等在土壤中都有存在。细茼在土壤中的分布方式一般是黏附于土壤团粒表面，形成菌落或菌团，也有一部分散布于土壤溶液中，且大多处于代谢活动活跃的营养体状态。但由于它们本身的特点和土壤状况不一样．其分布也很不一样。细菌积极参与着有机物的分解、腐殖质的合成和各种矿质元素的转化。
土壤中藻类的数量远较其他微生物类为小，在土壤微生物总量中不足1％。在潮湿的土壤表面和近表土层中，发育有许多大多为单细胞的硅藻或呈丝状的绿藻和裸藻，偶见有金萋和黄藻。在温暖季节的积水土面可发育有衣藻、原球藻、小球藻、丝藻、绿球藻等绿藻和黄褐的硅藻，水田中还有水网藻和水绵等丝状绿藻。这些藻类为光合型微生物，因此易受阳光和水分的影响，但它们能将CO2转化为有机物，可为土壤积累有机物质。
2.从周围环境中微生物存在的关产，你认为无菌操作要特别注意些什么？
答：操作前将界面上的细菌和病毒等微生物杀灭。操作过程中是界面与外界隔离,避免微生物的侵入。
3.打喷嚏或咳嗽时会传播细菌性疾病吗？
答：会，观察到对着培养基咳嗽的培养照片，可以观察到有菌落的生长。
4.说明饭前吸手，饭后刷牙的重要性？
答：手和牙表面存在着很多的细菌，可能对人造成一定程度的上海，因此，要注意个人卫生。
5.日常生活中如何讲究饮食卫生？
答：食物中可能会存在一定的细菌，对人的健康可能造成一定的伤害，因此要注意饮食卫生。
八 实验反思
1.以后实验要注意实验步骤的严谨性。
2.涂布器要涂均匀。
3.注意培养时间和培养条件。
4.注意实验中的无菌操作。
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