(整理)植物内生菌分离处理方法

d植物内生菌分离处理方法

文献	材料	前处理	第一次消毒	第二次消毒（含三消）	处理	对照	培养基
刘明志，2011	南方红豆杉的老树皮、幼茎、叶	截成2～3 cm长的小段，去除树皮层	75%酒精中浸泡30 s	0．1%溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次	研磨成匀浆液，倾倒于PDA上		切成0．5 cm左右的块，接种于有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。每皿10块
刘金花 2011	黄花蒿的根，茎，叶	叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口）	将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min	1%的次氯酸钙溶液浸泡1min,用无菌水冲洗5次	置于含双抗的VA培养基平板培养		待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离
宋培勇 2011	珙桐茎、叶和叶柄	将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段, 无菌水漂洗 2 次	75%酒精浸泡 1 min	再用 2% NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入 75%酒精中浸泡 30 s, 接着用无菌水漂洗 3 次,		取最后一次漂洗液涂布 NA 平板作为对照	平放于 NA 平板上, 28 °C培养 2−3 d
孙传伯2011	台湾7303毛豆全株	采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分, 并用无菌纸吸干水分,切取支根110 cm长的小段, 须根切成 115 cm的小块	用 75% 酒精浸泡 5m in、7m in、10m in	分别用 0.1% 溶液处理 4 m in、6 m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复 3次。最后用无菌水冲洗 4次,。最后用无菌水冲洗 4次	将组织块在研钵中充分研磨成匀浆	最后一次冲洗液涂 3种不同培养基平板, 26~ 28e 下培养2~ 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗 4次,取上清液涂抹于培养基上。以无菌水冲洗为对照试验。	取上清匀浆涂抹于 3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复 3次, 然后将培养皿置于26~ 28e 恒温箱中培养2~ 3d, 观察培养出的菌落形态
张鑫 2011	植物圣罗勒的健康叶子	将叶子用流水冲洗 10 min	1% 的次氯酸钠中浸泡 10 min	0． 02 mol / L、pH 7． 0 的无菌磷酸钾缓冲液( PB) 漂洗 4 次	加无菌水将材料研磨		涂布培养
李铭, 2011	石耳目地衣						为了诱导产孢，黑化菌株在光照/黑暗( 12 h∶ 12h) 条件下，于2%的 PDA 培养基上，18℃ 下培养 3 个月
刘杰凤 2011	健康的小白菜，染病的小白菜根，茎，叶	流水冲洗干净，剪成小段	75％酒精中浸泡3 min	10％次氯酸钠浸泡茎为8 min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5 min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3 min	无菌条件下用适量的 PBS 缓冲液捣碎	以最后一次的漂洗液作对照，30 ℃ 下培养一个星期	搅拌后静置3 min，取上清液0．5 mL分别涂布于分离培养基平板上，每种材料做3次平行
朱士茂 2011	新采集的银杏枝条，叶子和根	在自来水中冲洗干净，然后将枝条和根截成 3 －4cm 长，将叶子和叶柄分开，分别将根，枝，叶放在不同的灭菌后的广口瓶中	（1），根的表面灭菌: 0. 1%的土温 20 消毒 1min，无菌蒸馏水冲洗 2 次。（2）枝，叶和叶柄： 75% 的乙醇消毒 30s，无菌蒸馏冲洗 3 次	(一）,根：75%的乙醇消毒30s，无菌蒸馏水冲洗 2 次，0. 1% 消毒 5min，无菌蒸馏水冲洗 5 次。 (二）枝，叶和叶柄：0. 1% 消毒 7min，无菌蒸馏水冲洗 5 次	茎，将其表皮剥离，用无菌小刀纵切表皮取其中间的部分，然后将其切成 0. 5cm ×0. 5cm 大小第二节　安全预评价叶和叶柄，用研钵将叶磨碎 ( 内放石英砂和生理盐水) 然后用无菌移液管吸取0. 2ml 放入培养皿中	①将以上接入的每种平皿按相同的方法接入 5min 后用无菌镊子取出;②用无菌蒸馏水冲洗已表面灭菌后的材料，然后将此液体移入培养基中，培养观察。	环境影响的经济损益分析，也称环境影响的经济评价，即估算某一项目、规划或政策所引起的环境影响的经济价值，并将环境影响的经济价值纳入项目、规划或政策的经济费用效益分析中去，以判断这些环境影响对该项目：规划或政策的可行性会产生多大的影响。对负面的环境影响估算出的是环境费用，对正面的环境影响估算出的是环境效益。KB 培养基: PL 培养基: 一、环境影响评价的发展与管理体系、相关法律法规体系和技术导则的应用PDA 培养基:
肖淑贤 2011.	长势好、无病害的植株	在自来水中冲洗干净	采用、乙醇、H2O2、次氯酸钠等表面消毒剂进行消毒，无菌水冲洗		直接切取植物组织或榨取植物组织汁液稀释
一、环境影响评价的发展与管理体系、相关法律法规体系和技术导则的应用王剑峰 4.建设项目环境影响评价文件的分级审批2011	（一）环境影响经济损益分析概述取生长 15 天马铃薯	第五章　环境影响评价与安全预评价无表面灭菌方法		环境影响经济损益分析一般按以下四个步骤进行：		2.早期介入原则；	马铃薯内生菌单菌落的分离取生长 15 天马铃薯 LK99 组培苗,剪成长度约 1.0 cm 的带腋芽茎段接种于 PSA 培养基上,分别于光下(28℃、2200Lx、16hr 光/8hr 黑暗)或 28℃暗培养,3 天后光下和黑暗条件下组培苗周围的培养基上出现黄菌块,挑取黄菌块,用稀释涂布法[66]分离单菌落。
李晓红	影响支付意愿的因素有：收入、替代品价格、年龄、教育、个人独特偏好以及对该环境物品的了解程度等。不同表面消毒方法对核桃叶内生菌分离效果的比较	内容残缺）
熊亚南 2011	刺五加植株流水冲洗去土，根，茎，根茎等部	流水冲洗去土	按根，茎，根茎等部进行分割，每段长10cm左右，按下列程序表面消毒：无菌水冲洗→ 95%酒精漂洗1min→6%的Naclo浸3min	75%的乙醇漂洗0.5min→ 无菌水漂洗3次	进行分割，每段长10cm左右	同样处理的材料不做切割直接滚印于对照平板，并去最后一次漂洗的无菌水平板涂布，置相同条件下培养，无菌长出即为表面消毒彻底。	NA培养基。将上述处理过的材料韧皮部与木质部无菌分离，韧皮部切成约0.5cm×0.4cm的薄片，然后将薄片直插入和水平贴附两种方式置于分离平板上，25-28℃暗箱培养，带材料边缘有菌苔长出后转接与纯化平板划线法分离纯化，镜检验纯后转接到斜面。
邓正山 2012	健康的大蒜鳞茎	用纯净水冲洗干净	依次用体积分数７５％的乙醇浸泡３ｍｉｎ	０．１％的表面消毒１５ｓ，再用无菌水漂洗５次
杨明琰 2012	新鲜的杜仲	将新鲜植物材料用自来水冲洗外表面直至干净，晾干。用无菌刀将样品切割成３ｃｍ左右的小段	７５％的酒精溶液中浸泡６ｍｉｎ，用无菌水冲洗样品表面３～５次	再在４％的次氯酸钠溶液中浸泡３ｍｉｎ，用无菌水冲洗样品表面３～５次	用镊子及解剖取其韧皮部，切除两端后切成大约１ｃｍ×０．５ｃｍ的小段	①漂洗液检验法：把最后一次漂洗材料的无菌水涂布于ＰＤＡ平板上，２８℃恒温培养。②组织印迹法：将上述表面灭菌处理的完整枝段压入ＰＤＡ平板内，使表面灭菌材料与培养基接触３０ｍｉｎ后，移去植物材料，２８℃恒温培养。③组织压入法：将灭菌材料不经切割直接贴于ＰＤＡ培养基表面，２８℃恒温培养	将小段，贴于ＰＤＡ培养基的表面，每皿放３块材料，于２８℃恒温培养箱内培养５～１０ｄ。待菌丝从植物组织长出后，从边缘挑取菌丝移至另一ＰＤＡ平板上进行纯化
胡秀荣 2011	采集健康的柑橘植株	放线菌：先在自来水下冲洗掉样品表面的泥土，再用超声波清洗	放线菌：然后用99%乙醇处理1min，3%次氯酸钠处理5min	放线菌：最后用99%乙醇再处理30s	放线菌：灭菌好的材料用无菌刀切成1cm×1cm小块，置于分离培养基表面	放线菌：将最后一次处理植物样品的清洗液涂在ISP2培养基上，用以检测表面灭菌的效果
熊党生 2012	取新鲜健康的葛根的根、茎、叶	分别用水冲洗干净，用滤纸吸干水分	无菌水冲洗 2 遍，先用体积分数75% 酒精浸泡 3 ～ 5 min( 叶子 3 min，茎 4 min，根 5min) ，无菌水冲洗 3 ～ 4 遍	用 0． 1% 浸泡 2 ～ 4min( 叶子 2 min，茎 3 min，根 4 min) ，无菌水冲洗 4 ～5 次	在无菌的条件下，用灭过菌的手术剪刀将植物根、茎、叶剪成小段，从中间剪开后，分别置于含有葛根浸出夜的 PDA 琼脂培养基上，置于生化培养箱中培养一段时间	将上述经过表面消毒后未作任何处理的材料直接置于平板中，27℃培养，结果材料周围未见任何菌长出，证明所分离的菌株为葛根的内生菌。	挑取内生细菌到牛肉膏蛋白胨培养基中，挑取内生真菌的菌丝到 PDA 培养基中纯化数次，将纯化好的菌种接种到斜面培养基上保存备用
张彦涛 2012	白蜡、茅草、射干、罗布麻、蓼草、胡杨、怪柳。	取采集的新鲜样品，用蒸馏水将植物表面洗净	干后分别取其根、茎、叶，在 75% 乙醇消毒液中浸泡 3～5min	3% 次氯酸钠浸泡 5min，75% 乙醇浸泡5min。最后用无菌水冲洗 3～4 次	将样品在灭菌的研钵中研磨，加适量无菌生理盐水研磨至匀浆状	最后一次冲洗的无菌水涂布平板做空白对照	（分离培养基）取 1mL 液体分别按照 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7依次梯度稀释，并分别涂布平板，37℃恒温培养 2d。
红树林内生放线菌	文件不完整
李雁津2012	完整交城骏枣,	用自来水清洗表面后再用无菌水冲洗,晾干称重后浸入30%的乙醇中3 min	浸入2.6%的次氯酸钠溶液中5 min	浸入30%的乙醇中30s进行表面消毒,最后用无菌水冲洗5次,晾干	用无菌剪刀将枣果去皮,果肉剪碎,加入无菌生理盐水研磨	取最后一次淋洗水150微升涂于LB平板上,28°C培养72小时,检测表面灭菌效果。	将碾磨液分别涂布于胰酶大豆琼脂培养基(TSA)、任氏培养基(R2A)、金氏培养基(KMB)、肉汁胨培养基(BPA)、 LB培养基、酵母膏蛋白胨琼脂培养基(YPM)、无氮培养基,28°C培养箱中倒置培养3-7天。

张慧茹 2012	挑选新鲜、生长旺盛的葎草，用保鲜袋包装	用自来水冲洗干净，置无菌操作台中紫外灯照射 5 min 后晾干。	用 75%酒精进行全草消毒1 min	消毒时间分别为：根65 s、茎 50 s、叶 35 s。再用无菌水冲洗干净	将上述组织块剪成 0.5 cm×0.5 cm大小	分别取各种组织最后一次冲洗的无菌水，涂布于营养琼脂平板上；将表面消毒处理过的完整的根、茎、叶各组织贴压在PDA 培养基平板内；在超净工作台内放置一敞开的PDA 平板。将上述 3 种对照平板置于 28 ℃恒温培养箱内培养 7 d，用于检查表面灭菌效果。	置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，28 ℃恒温培养箱中培养约 5~7 d，待内生菌长出后，挑取单个菌落进行纯化，PDA 培养基斜面保菌。
李勇 2011	健康人参	自来水将人参根表面粘连的土壤清洗，再用无菌水冲洗 1 次	依次用70% 乙醇浸泡 3 min	2. 6% 次氯酸钠浸泡 5 min，再用 70%乙醇浸泡 30 s。最后用无菌水淋洗 5 次	将无菌人参根剪成碎块，放入无菌研钵中，加入适量无菌石英砂和生理盐水( 0. 85%) ，充分研磨，梯度稀释 1 万倍	取最后一次淋洗液 150 μL 涂平板，28 ℃培养 3 d，观察平板上是否有菌长出	。取 200 μL 稀释液至细菌分离培养基，涂布均匀。25 ℃恒温培养 7 d，记录每个平板上的菌落形态及菌落数，纯化培养。
林娜 2012	随机挑选100g 左右根、茎、叶、果实	洗净风干	75% 乙醇分别浸泡 2、3、1、1 min，无菌水冲洗6 次，无菌滤纸吸干	0．1%HgCl2分别浸泡50、60、40、40 s，无菌水冲洗 6 次	加无菌石英砂研磨，梯度稀释至 10－ 3，每一稀释梯度涂布10 个分离平板	每个样品都取最后一次无菌水洗液涂于相应平板上，以检测表面消毒是否彻底	定期观察分离平板，挑取单菌落划线纯化于牛肉膏蛋白胨斜面上。
张鑫 2012	无纹背苔藓	取苔藓叶片用无菌水洗净	紫外先线（功率18QW）照射6min（苔藓叶正反面个照射30min）灭菌	然后用75%的酒精漂洗15min ，用无菌水冲洗3次，再利用酒精灯火焰进行表面灭菌	将验证表面无菌的叶子于无菌碾钵中碾磨，用无菌水梯度稀释	将表面灭菌的叶子直接贴于固体PDA和LB培养基表面，28℃ 培养3-4h，观察叶子周围是否长菌，以检验鲜苔表面灭菌是否彻底。	各取200微升稀释液涂布于固体PDA和LB培养基进行内生菌的分离。根据菌落形态，颜等特征初步判断处分理出菌落的中类，并按常规的方法挑取菌落保存。
蓝江林 2012	香蕉，处于成果期的健株和病株各 1 株	将样品用自来水冲洗干净，吸干水分，称重	先用75%酒精浸泡 40 s 左右，用无菌水充分淋洗	再用10% KClO3溶液浸 8 min，无菌水反复淋洗，无菌滤纸吸干	根部选取根尖和根基部分;假茎部从茎基部到茎顶端等分为 5 段，每段随机取样; 叶片根据生长的位置分为上部、中部和下部叶片，每部分取叶基部中部和叶尖部分	以组织消毒后无菌水淋洗的最后淋洗液作为对照, 涂 NA 平板培养，如长菌落, 则判定研磨液所培养的菌落为非内生菌, 丢弃; 若对照中无菌落, 则基本可判定研磨液中长出的菌落可能是内生菌，纯化后保存待用。	在无菌研钵中充分研磨匀浆，无菌水梯度稀释至 102、103和 104，取 200 μL 稀释液涂布于 NA平板上，每梯度 3 个重复，静置 20 min 后，30℃倒置暗培养 24 ~ 48 h。
史应武 2012	新疆醉马草	将醉马草的根、茎、叶( 包括叶鞘) 、种子分别用自来水冲洗干净，	再用无菌水冲洗一次; 在 75% 的0乙醇浸泡 30s 将醉马草的根、茎、叶( 包括叶鞘) 、种子分别用自来水冲洗干净	然后在 0. 1% 的中浸泡 1 min; 无0菌水淋洗 5 次，在无菌条件下晾干		取最后一次淋洗水涂于 LB 平板上，28℃ 培养 72 h，检测表面灭菌效果
马赟 2012	阿尔泰虫草	取阿尔泰虫草用水粗洗	再用乙醇擦洗2min	然后在 0. 1% 溶液中消毒 3 min，无菌水冲洗 4 ～ 6次	将虫草切成 0. 1 ～0. 5 cm 长的小段		将小段接到马铃薯培养基( PDA) 、LB 培养基培养

刘明志。南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364

剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次。用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA固体培养基上培养。红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。

1刘金花。黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。２０１１，３３（４）：２７～３０

黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的VA培养基平板

培养泡1min,用无菌水冲洗5次。待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。

2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 8−13

将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗 2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用 2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入 75%酒精中浸泡 30 s,接着用无菌水漂洗 3 次, 平放于 NA 平板上, 28 °C培养 2−3 d。取最后一次漂洗液涂布 NA 平板作为对照。

内生菌分离和纯化。将 NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离 1-2 次直到获得纯培养

3孙传伯。毛豆内生菌的分离及生物学特征观察。(2011)10- 0026- 02

（1）从供试材料上取植物组织 1. 0 g, 用 70% (体积分数 )酒精浸泡 30 s, 用无菌水漂洗后, 置于 1% (体积分数 )次氯酸钠水溶液中表面消毒 3- 5m in(其中叶片和花消毒 3 m in, 茎和果消毒 5m in), 再取出植物组织用无菌水冲洗 3次. 样品晾干后分别置于无菌研钵中加 5

mL 无菌水研磨成浆状, 静置 10- 15 m in后, 每一样品各取上层澄清液 50 LL 分别涂布在培养基 ( NA、KB和 TSA ) 平板上, 每种培养基涂布 3皿, 28 e 黑暗培养48- 72 h, 计算每一平板的菌落数. 表面消毒后, 在研磨前取 50 LL 无菌水冲洗液涂布平板;或是通过组织印迹试验, 将最后一次清洗的植物组织在培养基平板上印一下, 按上述条件培养 48 h, 观察有无菌落产生, 以验证采用该消毒方法是否能杀死供试材料表生微生物. 根据菌落形态、颜等挑取单菌落, 划线分离、纯化后保存、备用.在融化并冷却至 45 e 的NA 培养基中加入待测病原菌的悬浮液, 其中每 100 mL 培养基加 1 mL 细菌悬浮液, 倒入平板. 采用点接法将内生菌接种于 NA平板上, 每个平板上等距离点接 5株不同的内生细菌菌株, 每组进行 2次平行试验, 在恒温箱中 28 e 下培养, 2 d后观察有无抑菌圈生成.

（2）采用组织切块法, 进行表面消毒,再用灭菌的蒸馏水清洗, 检验灭菌效果。内生细菌的分离前,将采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分,切取支根 110 cm 长的小段, 须根切成 115 cm的小块, 进行组织表面清毒, 棉花根部切段后经无菌水冲洗 3次,用 75% 酒精浸泡 5m in、7m in、10m in后, 然后分别用 011% 溶液处理 4 m in、6 m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复 3次。最后用无菌水冲洗 4次, 最后一次冲洗液涂 3种不同培养基平板, 26~ 28e 下培养2~ 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花根部切块

放入灭菌研钵中用无菌水冲洗 4次,取上清液涂抹于培养基上。以无菌水冲洗为对照试验。培养 2d后观察灭菌效果, 直到彻底表面灭菌, 再进行最后的内生菌分离。将组织块在研钵中充分研磨成匀浆,取上清匀浆涂抹于 3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复 3次, 然后将培养皿置于26~ 28e 恒温箱中培养2~ 3d, 观察培养出的菌落形态。

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