2021年4月
第31卷㊀第4期
中国比较医学杂志
CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINE
April,2021
Vol.31㊀No.4
李国祥，潘玥，胡鹏，等.新生乳鼠侧脑室注射rAAV2/9递送SNCA 构建全脑转基因鼠[J].中国比较医学杂志,2021,31(4):91-98. Li GX,Pan Y,Hu P,et al.Neonatal rAAV2/9delivery of SNCA to generate whole-brain transgenic mice [J].Chin J Comp Med,2021,31(4):91-98.
doi:10.3969/j.issn.1671-7856.2021.04.014
[基金项目]中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-I2M -2-001;2016-I2M -1-004)㊂[作者简介]
李国祥(1994 )，男，在读硕士，研究方向：药理学㊂E-mail:ligx@student.pumc.edu [通信作者]马开利(1981 )，男，副研究员，博士，研究方向：药理学和毒理学㊂E-mail:makaili@imbcams
新生乳鼠侧脑室注射rAAV2/9递送SNCA 构建
全脑转基因鼠
李国祥1，潘㊀玥1，胡㊀鹏1，杜廷福1,2，马开利1,2∗
(1.中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所药物安全性评价研究中心，昆明㊀650118;
2.中国医学科学院&北京协和医学院医学灵长类研究中心&神经科学中心，北京㊀100005)
㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀快速高效地构建一种人源SNCA (h SNCA )的全脑转基因鼠，并初步探究α-突触核蛋白过表达 对小鼠中枢神经系统的影响㊂方法㊀对新生乳鼠进行双侧侧脑室(intracerebroventricular,ICV)注射携带人源SNCA-EGFP 或EGFP 的重组腺相关病毒2/9(recombinant adeno-associated virus2/9,rAAV2/9)(1. 5ˑ1013genome copies(GC)/mL)，在2周和3个月龄用免疫荧光及Western blot 检测α-突触核蛋白的表达模式及亚细胞定位，并用免疫荧光及免疫组化探究星形胶质细胞㊁小胶质细胞及病理性α-突触核蛋白的变化㊂结果㊀用rAAV2/9侧脑室注射的方式成功构建了h SNCA 全脑转基因鼠,α-突触核蛋白在整个脑中广泛表达，且趋向于在嗅球㊁皮层㊁海马㊁间脑及中脑中高表达㊂进一步研究发现，在嗅球㊁皮层㊁海马的CA2/3区及小脑的浦肯野细胞中观测到α-突触核蛋白在神经元胞核中表达的现象,α-突触核蛋白过表达引起了胶质增生㊂此外，在嗅球及大脑皮层检测到α-突触核蛋白Ser129磷酸化(pS129)及聚集㊂结论㊀快速成功地构建了一种h SNCA 全脑转基因小鼠模型，其α-突触核蛋白持久地高表达，并出现胶质增生和病理性α-突触核蛋白表达的现象，为研究α-突触核蛋白的生理功能及其在帕金森病(Parkinson s disease,PD)中的作用奠定一定的基础㊂
ʌ关键词ɔ㊀α-突触核蛋白；转基因；乳鼠注射；胶质增生
ʌ中图分类号ɔR-33㊀㊀ʌ文献标识码ɔA㊀㊀ʌ文章编号ɔ1671-7856(2021)04-0091-08
Neonatal rAAV 2/9delivery of SNCA to generate whole-brain transgenic
mice
LI Guoxiang 1,PAN Yue 1,HU Peng 1,DU Tingfu 1,2,MA Kaili 1,2∗
(1.Institute of Medical Biology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,
Kunming 650118,China.2.Medical Primate Research Center &Neuroscience Center,Chinese Academy of
Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100005)㊀㊀
ʌAbstract ɔ㊀Objective ㊀To establish a human SNCA whole-brain transgenic mouse model,and to obtain
preliminarily data on the role of α-synuclein in the central nervous system.Methods ㊀rAAV2/9(1ˑ1013genome copies (GC)/mL)carrying either human SNCA-EGFP or EGFP was bilateral injected intracerebroventricularly in mice at postnatal day 0.The expression pattern and subcellular localization of α-synuclein was examined at 2weeks and 3months of
age by immunofluorescence and Western blot.Glial profile and pathological changes were analyzed by immunofluorescence and immunohistochemical staining.Results㊀h SNCA transgenic mice were successfully constructed,andα-synuclein was widely expressed throughout the brain,with high expres
sion in the olfactory bulb,cerebral cortex,hippocampus,interbrain and midbrain.Furthermore,nuclearα-synuclein was detected in the olfactory bulb,cerebral cortex,CA2/3of the hippocampus and Purkinje cells of the cerebellum.Overexpression ofα-synuclein caused the proliferation of astrocytes and microglia.In addition,pS129and aggregation ofα-synuclein were observed in the olfactory bulb and cerebral cortex. Conclusions㊀h SNCA whole-brain transgenic mouse model was established successfully,with high long-term expression of α-synuclein and enhanced gliosis andα-synuclein pathology.This model should be useful for studying the physiological function ofα-synuclein and its role in Parkinson s disease.
ʌKeywordsɔ㊀alpha-synuclein;transgene;neonatal injection;gliosis
㊀㊀帕金森病(Parkinson,s disease,PD)是第二大常见神经系统退行性疾病，其主要特征是中脑黑质多巴胺能神经元的死亡及α-突触核蛋白的聚集[1]㊂然而,α-突触核蛋白在PD中确切的功能尚未完全研究清楚㊂动物模型无疑是研究蛋白质功能及PD 发病机理的一个重要工具，目前迫切地需要一些动物模型去探究α-突触核蛋白确切的生理功能及进行药物研发的评估㊂尽管已经开发出许多模型，如毒素模型和转基因动物模型，部分能表现出黑质及纹状体多巴胺能神经元减少或多巴胺(dopamine, DA)水平降低以及行为障碍[2-6]，表明α-突触核蛋白的积累可以显著影响DA能神经元的功能，但在大多数小鼠中都没有发现明显的黑质及纹状体变性[7-9]，不能完美地再现PD的病理特征[10]，给PD 的研究带来了困
扰㊂
在最近的研究中，有学者尝试用rAAV在成年鼠中以脑立体定位注射的方式构建α-突触核蛋白局部过表达动物模型，能初步重现PD的原发性运动障碍及部分多巴胺能神经元损伤[11-14]，表明rAAV可以作为一种快速靶向的动物模型建立的工具，然而靶向和局部α-突触核蛋白过表达有一定的局限性，局部注射的rAAV只在部分脑区传导表达，而PD的发生发展可能由多个脑区的共同参与㊂最近研究表明，可以通过向胎鼠或乳鼠脑室内注射rAAV来实现整个中枢神经系统的基因表达[15-18]，与成年鼠注射病毒相比，这种方法可实现更有效的扩散和感染，且表达在注射后数天内开始，并持续于动物的整个生命周期[19-21]㊂且有报道称rAAV2/ 9能跨越血脑屏障，表现出在中枢神经系统广泛传导的能力[22]，并能感染新生神经元[21,23]㊂此外，人源SNCA(h SNCA)转基因小鼠模型已经被广泛应用和认可，人源α-突触核蛋白在小鼠中并不会引起强烈的免疫排斥反应而被清除，可长期表达存在[5-6,24]㊂因此，本文旨在通过对新生乳鼠ICV注射携带人源的SNCA-EGFP基因或EGFP的rAAV2/ 9，快速高效地构建脑中广泛表达α-突触核蛋白的转基因模型，并初步探究α-突触核蛋白过表达对小鼠脑的影响㊂
1㊀材料和方法
1.1㊀实验动物
SPF级C57BL/6小鼠30只,8周龄，体重20~ 22g，雌雄2ʒ1，由中国医学科学院医学生物学研究所小动
物部提供[SCXK(滇)K2019-0002]㊂动物饲养在中国医学科学院医学生物学研究所药物安全性评价研究中心20ħ~24ħ的屏障环境中[SYXK(滇)K2018-0006]，自由进水和进食，采用昼夜12h间断照明㊂在实验前以雌雄2ʒ1的比例合笼，见栓后把母鼠分离单独饲养㊂给予充足的食物和水源，在母鼠妊娠后第1天(postnatal day,P0)进行病毒注射并标记后继续给予充足的食物和水源饲养㊂实验经本单位伦理委员会审核批准(DWSP202012008)，实验过程按实验动物使用的3R原则给予动物人道关怀㊂
1.2㊀主要试剂与仪器
无内毒素质粒小提取试剂盒(货号: CW2106S)㊁BCA蛋白定量试剂盒(货号:CW0014S)购自康为科技有限公司；只与人源α-突触核蛋白反应的兔多克隆抗体α-synuclein(MJFR1)(货号: ab138501)㊁NeuN鼠单克隆抗体(货号:ab104224)㊁DAPI(货号:ab104139)购自英国abcam;GFAP鼠单克隆抗体(货号:Cat#G3893)及固绿(货号:F7252)购自美国Sigma;Iba1兔多克隆抗体(货号:016-20001)购自日本wako；抗聚集性α-synuclein(5G4)
单克隆抗体(货号:MABN389)购自美国Merck；鼠α-synuclein单克隆抗体(货号:610786)购自美国BD；兔来源TH多克隆抗体(货号:PA5-85167)购自美国Invitrogen;GAPDH单克隆抗体(货号:60004 -1)购自美国Proteintech;594波长免疫荧光兔二抗(货号:A11012)及488波长鼠二抗(货号:A11001)购自美国Invitrogen;Western blot兔源荧光二抗(货号:926-32211)及鼠源荧光二抗(货号:926-32210)购自美国Li-cor；免疫组化试剂盒(货号: GK5000705)购自上海基因科技；微量注射器购自瑞士Hamilton㊂
1.3㊀实验方法
1.3.1㊀质粒构建及病毒包装
pAAV-hSyn-EGFP㊁pAAV-hSyn-SNCA-PGK-EGFP 质粒由本实验室构建和保存㊂两种质粒在大肠杆菌中扩增后用质粒小提试剂盒提取质粒DNA并鉴定㊂携带人源SNCA-EGFP及EGFP的重组腺相关病毒rAAV2/9由泰尔图公司包装并纯化，其病毒滴度约为1.5ˑ1013GC/mL，冻存在-80ħ冰箱中待用㊂1.3.2㊀新生乳鼠侧脑室注射
在注射前把注射针头㊁镊子和剪刀高压灭菌㊂取1.5μL病毒与0.5μL的固绿混合，充分混匀并置于冰上，固绿用于标记注射位点㊂出生后第1天(P0)的乳鼠与母鼠分离，置于冰上2~3min充分麻醉，用5μL Hamilton微量注射器注射小鼠侧脑室，进针深度为3mm，注射速度约为1μL/min，每侧注射1μL，注射后留针1min㊂注射结束时擦拭75%乙醇并标记后放入笼中继续饲养2周或3个月进行解剖检测㊂
1.3.3㊀Western blot
处死小鼠取脑并分离各个脑区置于冰冷的EP 管中，加入适量的RIPA裂解后，取上清用BCA试剂盒进行蛋白定量，之后加5ˑ上样缓冲液进行煮沸5min待用㊂配置SDS-PAGE胶，上样,85V电压跑胶120min后，用半干转仪进行转膜,5%脱脂牛奶室温封闭45min后，抗体孵育4ħ过夜,TBS洗膜5 minˑ3次后，用
羊抗鼠或抗兔的Western blot荧光二抗室温孵育1h,TBST洗膜3次后,Odyssey红外激光扫描系统进行显影拍照㊂
1.3.4㊀免疫荧光
用多聚甲醛对2周或3个月的rAAV2/9ICV注射小鼠进行灌注，取脑后用多聚甲醛固定24~36h，脱水机脱水处理，包埋后切片厚度为4μm㊂切好的片子65ħ孵箱烤片，常规脱蜡水化，蒸馏水冲洗,
PBS浸泡5min,Tris-EDTA缓冲液微波炉煮沸进行抗原修复15min，蒸馏水浸泡5min，正常山羊血清室温封闭1h后，滴加相应稀释好的一抗4ħ过夜, PBS洗5minˑ3次，后滴加鼠或者兔来源的荧光二抗,DAPI封片后用Panoramic MIDI获取图片㊂1.3.5㊀免疫组化
多聚甲醛对2周或3个月的rAAV2/9ICV注射小鼠进行灌注，取脑后用甲醛固定24~36h，脱水机脱水处理，包埋后切片厚度为4μm㊂切好的片子65ħ孵箱烤片，常规脱蜡水化，蒸馏水冲洗,PBS浸泡5min，用Tris-EDTA缓冲液微波炉煮沸进行抗原修复15min，蒸馏水浸泡5min,3%过氧化氢孵育30 min去除内源性过氧化氢酶，正常山羊血清室温封闭1h后，滴加抗α-synuclein(MJFR1)兔多克隆抗体及Iba1兔多克隆抗体,4ħ过夜㊂PBS洗5minˑ3次，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5h,PBS洗5minˑ3次，新鲜配置的DAB显液㊂苏木素复染3min，盐酸乙醇脱，氨水返蓝，梯度乙醇及二甲苯脱水，树胶封片，用Panoramic MIDI获取图片㊂
2㊀结果
2.1㊀新生乳鼠侧脑室rAAV2/9注射构建h SNCA 转基因模型
为了高效构建一种h SNCA转基因鼠模型，我们按照如图1A上所示方法对新生乳鼠侧脑室注射rAAV2/9㊂在注射后，病毒扩散到各个脑室中(图1 A下)，表明注射位点是准确的㊂两周后，用只与人源α-突触核蛋白反应的Anti-α-synuclein(MJFR1)抗体进行免疫荧光染检测α-突触核蛋白在整个脑区的表达水平㊂结果如图1B所示，在对照组AAV-EGFP中，未出现α-突触核蛋白阳性染，表明抗体的特异性良好，不会与鼠源α-突触核蛋白发生交叉反应，而在实验组AAV-SNCA中，检测到α-突触核蛋白广泛表达在转基因鼠的各个脑区㊂为了验证这个结果，采用Western blot分别检测2周(图1C)及3个月(图1D)年龄的鼠嗅球(olfactory bulb,OB)㊁皮层(cerebral cortex,CTX)㊁海马(hippocampus,hip)㊁间脑(interbrain,IB)，中脑(middle brain,Mid)，小脑(cerebellum,CB)，后脑
(hindbrain,HB)中α-突触核蛋白的表达，结果显示α-突触核蛋白在各个脑区中均表达，其中在小脑中表达量稍低，与免疫荧光结果一致㊂这些结果表明转基因鼠构建成功，且α-突触核蛋白广泛持久地表达(2周~3个月)，人源α-突触核蛋白并未发生强烈的免疫排斥反应而被清除
㊂
注:A：新生乳鼠注射方式模式图;B:2周龄鼠α-突触核蛋白的免疫荧光染;C:Western blot 检测2周龄鼠脑中人源及总的α-突触核蛋白(人+鼠)在对照及转基因小鼠各个脑区的表达;D:Western blot 检测3月龄鼠脑中人源及总的α-突触核蛋白(人+鼠)在对照及转基因小鼠各个脑区的表达㊂GAPDH 作为内参㊂
图1㊀SNCA 转基因鼠的构建
Note.A,Cartoon describes the surgical approach for ICV injection in neonatal mouse brains.B,Immunofluorescence stain reveals the expression of α-synuclein in the whole brain at 2weeks.C,Level of human and total α-synuclein expression in the transgene was assessed by Western blot at 2weeks.D,Level of human and total α-synuclein expression in the transgene were assessed by Western blot at 3months.GAPDH was used as an internal
control.
Figure 1㊀Construction of SNCA transgenic mice
2.2㊀ICV 注射rAAV2/9后α-突触核蛋白在全脑广泛表达
为了进一步探究转基因鼠中α-突触核蛋白的表达模式，用α-突触核蛋白特异性抗体的免疫组织化学染检测2周龄鼠嗅球(olfactory bulb,OB)㊁皮层(cerebral cortex,CTX)㊁海马(hippocampus,Hip)㊁间脑(interbrain,IB)㊁中脑(middle brain,Mid)和小脑(cerebellum,CB)中α-突触核蛋白的表达㊂结果显示,α-突触核蛋白在嗅球中高表达(图2A)，少部分分布在胞核中㊂在大脑皮层处(图2B),α-突触核蛋白高表达并主要分布在胞质中，而在海马的CA2/
3区(图2C),α-突触核蛋白广泛分布在颗粒细胞层的胞质及胞核中㊂在间脑中(图2D),α-突触核蛋白广泛
分布在丘脑及下丘脑中㊂在中脑(图2E)中,α-突触核蛋白亦高表达，并主要在胞质中㊂有趣的是,α-突触核蛋白特异性地表达在小脑的浦肯野细胞中(图2F)㊂
2.3㊀ICV 注射rAAV2/9后α-突触核蛋白的表达定位
蛋白质的表达定位往往与其特定的功能相关，我们通过免疫荧光检测2周龄鼠中人源α-突触核蛋白的亚细胞定位㊂结果显示，在多巴胺能神经元(TH +神经元)中,α-突触核蛋白高表达，且其主要表达于神经元胞质中(图3A)㊂在其它脑区，如图3B 所示，嗅球及皮层中有少部分α-突触核蛋白表达在胞核中，而在海马的CA2/3区，少数颗粒细胞的胞核中出现α-突触核蛋白核定位的现象，在小脑处,α-突触核蛋白在浦肯野细胞核中高表达，其结果与图2F 一致㊂
2.4㊀ICV 注射rAAV2/9后诱导胶质细胞增生
大量的研究表明PD 的发生可能与神经炎症密切相关㊂于是，通过免疫荧光检测3月龄转基因鼠脑中星形胶质细胞的数量(GFAP +细胞)，如图4A 所示，在黑质(Substantia nigra,SN)中,α-突触核蛋白广泛表达的区域出现星形胶质增生的现象，而在海马中(图4B)得到了同样的结果,GFAP +胶质细
注：免疫组化分析2周龄鼠人源α-突触核蛋白在各个脑区中的表达㊂A：嗅球(OB);B：皮层(CTX);C：海马(Hip);D：间脑(IB);E：中脑(Mid);F：小脑(CB)㊂后图为局部放大图㊂
图2㊀转基因鼠中α-突触核蛋白在各个脑区中广泛表达
Note.Level and distribution of humanα-synuclein expression were evaluated histologically.A,Olfactory bulb(OB).B,Cerebral cortex(CTX).C, Hippocampus(Hip).D,Interbrain(IB).E,Middle brain(Mid).F,CB Cerebellum(CB).A partial enlarged view is attached after the figure.
Figure2㊀Widespreadα-synuclein expression of the transgene throughout the mice brain
胞也显著地增生㊂此外，免疫组化染检测的小胶质细胞在海马(图4C)及皮层(图4D)也显著增生㊂2.5㊀ICV注射rAAV2/9后出现病理性α-突触核蛋白
在PD中，第129位丝氨酸磷酸化(pS129)及聚集形式的α-突触核蛋白常被检测到，被认为是PD 的标志之一㊂在转基因鼠中，我们通过免疫组化检测表明,pS129在3月龄小鼠嗅球及皮层中(图5A)均出现，且在嗅球的神经元中强阳性染㊂进一步用抗聚集形式的α-突触核蛋白单克隆抗体(α-
synuclein5G4)检测其表达时(图5B)，发现其在嗅球和皮层亦出现阳性染，表达模式与pS129一致㊂3㊀讨论
rAAV的研究及广泛应用，为我们高效地基因传递提供了非常快速有效的工具，先前多项研究通过靶向小鼠黑质㊁纹状体及嗅球构建α-突触核蛋白局部过表达小鼠模型，极大地促进人们对PD发病机理的认
识，然而由于靶向定点脑区注射后蛋白质过表达的区域局限性，所以在该研究中，基于rAAV2/9在神经系统中的高效的传递效率[21-22]，我们通过新生乳鼠侧脑室注射携带人源SNCA-EGFP
或EGFP的rAAV2/9，构建了全脑人源α-突触核蛋
白高表达的转基因鼠㊂在注射rAAV2/9后立即解
剖乳鼠脑，发现固绿染的病毒液在大脑各脑室之
间扩散，表明注射位点的准确性㊂前期的研究表明
注射的时间点影响注射效率[15]，于是在本实验中严格控制注射时间在出生后12个小时之内㊂
在小鼠成长到2周或3个月后，用免疫荧光和Western blot实验检测到了2周及3个月龄α-突触核蛋白在全脑中广泛的表达(图1所示)，这表明通过乳鼠侧脑室注射的方式在注射后早期α-突触核蛋白便能高表达，提示可以用此模型探究α-突触核蛋白在小鼠出生后脑发育过程中的作用㊂此外, Western blot㊁免疫荧光及免疫组化实验表明,α-突触核蛋白趋向于在小鼠嗅球㊁皮层㊁海马㊁间脑及中脑中高表达，而在小脑中表达量稍低，这可能与病毒感染的细胞偏好性或者α-突触核蛋白表达的细胞偏好性有关，其具体的机理仍然需要进一步研究㊂此外，进一步通过免疫荧光探究α-突触核蛋白的亚细胞定位，发现在嗅球㊁皮层㊁海马及小脑中,α-突触核蛋白有胞核定位的现象，而之前的研究结果表
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