X-Y轴调节结肠癌肝转移的分子机制研究

1)通过基因芯片Microarray分析X过表达/沉默后基因表达谱变化情况，对原始数据进行归一化、标准化，差异表达分析，明确X消减后表达发生改变的下游调控分子，芯片结果中有显著差异的潜在作用分子，设计引物，通过qRT-PCR进行二次表达验证。

2)X基因过表达/沉默后发生显著表达差异的基因，利用Bayesian Network、Genes2Networks、Go-anaslysis软件进行signaling network 重建。解析X调控结肠癌细胞运动能力的信号通路网络，构建X为核心的信号分子网络。

3)根据X基因沉默后影响的信号通路结果（半乳糖基转移酶及其上游调节信号通路），利用信号通路抑制剂处理X稳定过表达/沉默后结肠癌细胞和对照细胞，检测不同分子信号对X表达及功能的作用，验证阻断这些信号通路后对X在结肠癌中的功能表型的影响。

4)采用信号通路高通量检测蛋白芯片，根据以上实验分析的通路情况，订购相应通路的Pathway Array试剂盒，按试剂盒操作，依据封闭、加入细胞裂解液、洗脱、加入抗体混合液、再次洗脱，加入辣根过氧化物酶HRP并洗脱、信号检测的步骤，检测X基因表达变化后的特定通路关键蛋白的变化。

5)分别构建X、Y的真核表达载体，共转293T，通过免疫共沉淀（Co-IP）基因调控网络验证XY的相互结合作用。

6)应用生物信息学技术模拟X与Y的结合位点。在结合位点制备不同氨基酸的突变体。采用RNAi方法敲减互作蛋白表达，接着转入互作蛋白的突变体，检测细胞功能表型变化。通过免疫共沉淀（Co-IP）验证X与Y之间的结合位点特异性。

7)EMSA实验验证X与Y之间的相互作用关系，参考蛋白相互作用实验，设计突变载体，再验证其结合特异性，由此揭示X作为Y调节蛋白其对下游RNA进行调控的精细机制。

本文发布于:2024-09-22 22:37:30，感谢您对本站的认可！

标签：表达通路信号检测细胞

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