戚 鹏 高春芳
（第二军医大学东方肝胆外科医院实验诊断科 上海 200438）
摘要 微小RNA（microRNA，miRNA
）是一类长度为二十几个核苷酸的内源性非编码调控RNA，通过序列特异性翻译抑制或mRNA裂解来调控基因表达，参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物学进程。近期的研究发现，miRNA
具有癌基因和抑癌基因的作用，在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。已发现若干miRNA直接参与肝细胞癌的发生和发展，miRNA表达谱与肝细胞癌的诊断、分期、进展和预后等相关。作为一类新的分子靶标，miRNA应用于肝细胞癌的诊断和生物具有广阔的前景。 肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是我国常见的恶性肿瘤，其死亡率位居第二。肝细胞癌的发生、发展是多因素、多步骤的复杂过程。寻肝细胞癌发生、发展的相关基因，了解肝细胞癌的分子遗传学机制从而为肝细胞癌的诊断、提供理论基础为目前的研究热点。微小RNA（microRNA，miRNA）是一些5′端带磷酸基团、3′端带羟基的，长度为二
十几个核苷酸的非编码调控RNA家族［1］。迄今在人类、动植物等物种中已有六千余种miRNAs被发现，通过调控基因表达来参与生命过程中的一系列重要进程，包括早期发育、细胞增殖、细胞分化以及细胞凋亡（MiRBasehttp：／／microrna．sanger．ac．uk／sequences／）。许多病毒也会与宿主的miRNAs相互作用，并且相当一部分病毒还能编码自己的miRNAs，调控自身蛋白的表达或者钝化宿主本身的防御系统［2］。最近多项研究发现，若干miRNAs在各种肿瘤组织中的表达水平有不同程度上调或下调，这一现象初步揭示了肿瘤发生与miRNA表达之间存在相关性。该领域的研究虽刚刚起步，新的发现与观点却层出不穷，miRNA与肿瘤的关系已成为当前众多科学家关注的热点之一。本文就miRNA与肝细胞癌的相关性作一综述。
1 miRNA来源和作用机制
与siRNA加工合成类似，miRNA也是由一系列RNaseIII内切酶和转运蛋白等逐步加工完成［3］。在细胞核内，首先由RNA聚合酶II或聚合酶III转录合成初级miRNA（pri?miRNA），经过Drosha及DGCR8剪切形成miRNA前体（pre?miRNA），然后在输出蛋白5（Exportin?5）和Ran复合物协助下转运出细胞核，随后在细胞质内，被Dicer／TRBP剪
切成21～25个核苷酸长度的双链RNA。通常，上述双链RNA中的一条单链会与RNA诱导的沉默复合体（RNA?inducedsilencingcomplex，RISC）结合，另一条链发生降解；也有一些miRNA双链会打开并分别与不同的RISC结合。miRNA5′端第2～8核苷酸与mRNA3′端非翻译区（untranslatedregion，UTR）部分序列的结合很重要，被称为种子序列（seedsequence）。miRNA参与的基因调控主要有两种方式，即靶mRNA的降解和翻译抑制。当miRNA和靶mRNA接近完全互补时多采取第一种方式，在植物中多见。而在动物中，多数情况下miRNA和靶mRNA3′?UTR不完全互补配对，通过翻译抑制靶mRNA的表达。此外，也可以具有以上两种作用模式，即当与靶基因完全互补结合时，直接切割mRNA，如果蝇和HeLa细胞中let?7直接介导RISC分裂切割靶mRNA；而当与靶基因不完全互补结合时，起调节基因表达的作用，如线虫中的let?7与靶mRNA3′?UTR不完全配对结合后，抑制基因的翻译［4］。最近Wu等［5］又提出另外一种去腺苷酸化机制也参与了miRNA的基因调控，已知lin?28mRNA的3′?UTR与miR?125b不完全互补，他们把miR?125b转入人类胚胎肾细胞293T后，观察到连接了lin?28的β?球蛋白mRNA明显缩短，这种缩短又与3′腺苷酸尾的清除有关。一个miRNA可调节数百个靶基因包括转录因子、细胞因子、受体等，几种miRNAs也可以联合调控单一基因的表达，miRNAs和靶基因组成了复杂
的调节网络［6］。揭示miRNA的作用机制对于我们认识体内miRNAs之间、miRNAs与mRNA之间、miRNAs与蛋白质以及与DNA之间的网络交互作用具有重要的意义。
2 miRNA与肿瘤的关系
从细胞生物学角度来看，动物生长发育过程是与其细胞增殖、分化和死亡相互联系的，而细胞增殖、分化和凋亡等生物学进程的异常在肿瘤中常见。miRNA在动物生长发育、细胞增殖、分化、凋亡及基因调控中的作用，引发了人们对miRNA与肿瘤之间关系的思考。
原癌miRNA组学（Oncomirs）这一崭新概念的提出，开辟了将miRNA应用于肿瘤细胞研究的新篇章［7］。如果miRNA在肿瘤中表达上调，就属于有致癌基因作用的miRNA，它通过负性抑制肿瘤抑癌基因和／或控制细胞的分化或凋亡途径来促进肿瘤的发展；而在肿瘤生成中，有些miRNA的表达是下调的，则这些miRNA起抑癌基因的作用。
2．1 有致癌基因作用的miRNA
在B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤及套细胞淋巴瘤中，miR?17?92基因簇（包括miR?17?5p、miR?17?3p、miR?18a、miR?19a、miR?20a、miR?19b?1和miR?92?1）似乎起着
癌基因的作用［8］。研究进一步证实，miR?17?5p、miR?20a的靶基因是转录因子E2F1，原癌基因c?Myc一方面促进细胞周期的进程，同时激活miR?17?92基因簇的表达，转录后抑制E2F1促细胞凋亡的作用，促使细胞逃离正常的凋亡途径，获得永生性。过表达c?Myc和miR?17?92基因簇的肿瘤与仅有c?Myc过表达的肿瘤相比，具有更强的增殖能力和更低的细胞死亡率［9基因调控网络］。此外，在人类B细胞肿瘤中及胰腺癌中发现另一和c?Myc有协同作用的miR?155／BIC的过表达［10～12］，miR?155直接参与了这些疾病的发生与发展。
Volinia等［13］用芯片分析了6种实体瘤（肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌、胰管癌）的miRNA表达谱发现，miR?21均显著过表达，提示其在肿瘤形成过程中起广泛的致癌作用。进一步的研究表明，miR?21通过直接下调抑癌基因tropomyosin?1（TPM?1）而发挥作用。Jennifer等通过对原代多形性恶性胶质瘤细胞、体外建立的6种恶性胶质瘤细胞系（A172，U87，U373，LN229，LN428，LN308）与正常的胎儿及成人脑组织以及体外培养的正常的神经胶质细胞的比较分析，发现在恶性胶质瘤中miR?21的表达水平也大大提升，且与caspases相关的细胞凋亡途径相关［14］。这些研究表明miR?21可能是通过抑制关键性的凋亡相关基因的表达而促进恶性肿瘤的形成。
2．2 有抑癌基因作用的miRNA
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首个肿瘤抑制基因miRNA是在慢性淋巴细胞白血病（chroniclymphocyteleukemia，CLL）患者的B细胞中被发现的。大约40％的CLL患者中有染体13q14的缺失，而miR?15a和miR?16?1基因正好位于该缺失位点LEU2内含子内，导致在约68％的CLL患者中这两个基因的表达缺失或下调［15］。bcl?2是一个抗凋亡基因，参与多种肿瘤的发生，Cimmino等［16］发现，正是miR?15a和miR?16?1的缺失导致bcl?2的过表达，使受损细胞不能凋亡，进而导致肿瘤的形成。研究还发现，2个CLL病人的miR?16?1前体的下游7个碱基中有一个C突变为T，导致miR?16?1表达水平下降，进一步证明其具有抑癌基因的作用。
miRNAlet?7家族是典型的有抑癌基因作用的分子。在肺癌、结肠癌等肿瘤的研究中发现，let?7负调控原癌基因Ras／let?60的表达［17，18］，但不影响RasmRNA的水平，说明let?7是通过抑制mRNA的翻译发挥作用，但不影响其转录作用。最近研究发现了let?7的另一靶癌基因———HMGA2，HMGA2作为一种原癌基因在良性和恶性间充质肿瘤等多肿瘤的形成中发挥作用［19，20］。进一步研究显示，let?7对HMGA2的作用主要依赖其3′?UT
R，由于染体移位毁坏了HMGA2的3′?UTR的结构，无法与let?7结合而失去let?7的抑制作用，产生肿瘤转化的特征性改变。我们可以设想，有抑癌基因作用的miRNA转录、转运、加工以及随后的与靶癌基因作用的任一环节的缺失，都可能扰乱基因的正常调控而导致肿瘤的发生。
肿瘤被认为是一种复杂的基因病，几乎在所有肿瘤的发生或发展过程中都有癌基因的过表达和／或抑癌基因的表达缺失。Calin等［21］研究发现50％以上的miRNA基因定位于与肿瘤相关的区域或脆性区域，与人类多种癌症有关。miRNA通过调控mRNA的转译或其稳定性来参与正常细胞稳定状态的维持，因此miRNA的异常表达则可能导致其相应靶基因的异常，但是将所有的miRNA分为致癌作用与抑癌作用的miRNA这两类也是不可能的，因为细胞还有严格进化的监督机制来维持正常细胞的稳定性，因此，可以认为不同的细胞类型中，同样的miRNA可能作为癌基因或抑癌基因，而且在某类型的细胞中任何一个miRNA的靶基因一般不会只有一个，而每一个靶基因又可能和多个miRNA相互作用，组成了错综复杂的调控网络，在转录后对各种基因进行复杂的调控，参与肿瘤的发生发展。对miRNA进行深入研究，将有助于我们对生物体各种生理病理机制的理解，促进对癌症等人类顽疾发病机制的研究，并最终可能为癌症的诊断和提供新的思路和理论基础。
3 miRNA表达谱在肝细胞癌发生、发展及中的研究进展
近年不断涌现对miRNA进行高通量检测的相关技术，比如miRNA芯片［22］、磁珠流式细胞miRNA表达谱检测［23］、定量聚合酶链式反应（quantitativepolymerasechainreaction，qPCR）［24］等，通过癌组织及癌旁正常组织的横向比较出癌组织中特异表达的miRNAs，并对各期进行纵向比较，出肿瘤各期差异的miRNAs，从而完成对肿瘤的诊断和分期。miRNA的微阵列表达谱是一种快速、高通量的检测手段，大规模分析单个样本的表达谱的研究可以在条件均一的情况下同时完成；同时在微阵列设计时可以将miRNA的前体和成熟的miRNA设计在一张微阵列上同时检测，与Northern等检测方法相比需要的总RNA量相对更少，在肿瘤发生过程中进行miRNA表达谱的鉴定有利于发现基因的新靶点，并提高疾病诊断的正确性，某些特定的miRNA甚至被证明可以用于精确地预测病人的预后，可能为临床上确定一个方案提供一个强有力的工具。
3．1 miRNA与肝细胞癌的发生
肝细胞癌的发生与多个癌基因与抑癌基因及其产物的表达及结构异常有关，如上文所述，
miRNA既可以起到致癌基因的作用，又参与抑癌基因相关的肿瘤发生途径，其在肝细胞癌发生中的作用补充、丰富了肿瘤的发生机制。
Murakami等［25］首次对包括慢性乙肝、丙肝、肝硬化及肝细胞癌等肝脏性疾病患者肝组织miRNA表达谱进行了系统地比较性分析。研究发现慢性乙肝、丙肝患者miRNA表达谱无显著性差异；慢性肝炎患者的miR?182，pre?miR?199b，miR?224和miR?15b较肝硬化患者表达水平上调，而miR?28，miR?342，miR?126，miR?199a，miR?145b，miR?143，miR?368和pre?miR?372表达水平下调；肝癌组织中miR?18，pre?miR?18和miR?22较正常组织有更高水平的表达，miR?199a ，miR?195，miR?199a，miR?200a和miR?125a表达水平降低。以这些差异表达的miRNAs来区分癌变组织与正常组织，精确度能够达到惊人的97％。功能学研究发现，结缔组织生长因子（CTGF）和核因子?κB受体活化因子配体（RANKL）是miR?18的靶基因，而低表达miR?199a 会过度激活肝细胞由G2期向M期的转换，从而可能诱发肝细胞癌的发生。
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