导读：10 年前，我们开启了细胞核内 miRNA 的研究；5 年前，我们发表了第⼀项核内 miRNA
研究成果，发现并定义了⼀类在细胞核内具有激活功能的 miRNA——NamiRNA (Nuclear
activating miRNA)，提出了 NamiRNA-增强⼦-基因激活的新理论；5 年后的今天，我们发表了NamiRNA 第⼆项重要研究成果，揭⽰了肿瘤中抑癌基因沉默的新机制，为唤醒沉默的抑癌基因
提供了全新的思路。
抑癌基因失活是细胞癌变过程中常发⽣的事件。DNA 甲基化可调控基因的活性，启动⼦区域的
⾼甲基化通常会抑制基因表达，这可以解释细胞癌变过程中部分抑癌基因的失活。然⽽，⼤量 的抑癌基因启动⼦区域并没有出现所预想的⾼甲基化，这些抑癌基因在肿瘤中的低表达就成了
肿瘤领域的未解之谜，如何唤醒沉睡的抑癌基因更成了肿瘤研究领域可望⽽不可及的梦想。
癌基因和抑癌基因是我们⽣物医学领域⽿熟能详的名词，癌基因的⾼表达或获得性突变以及抑
癌基因的低表达或缺失性突变被认为是肿瘤发⽣的最重要的原因(1,2)。抑癌基因⼀个显著的特
征是在肿瘤中低表达。我们不禁要问两个重要的问题：1）抑癌基因为什么会在肿瘤中的低表
达？2）如何激活抑癌基因⽤于肿瘤的？
关于抑癌基因为何在肿瘤中低表达，这涉及肿瘤表观遗传学领域早期的著名争论——肿瘤到底
是与低甲基化还是⾼甲基化有关，这⼀争论时间跨度长达 15 年。这就不得不提到肿瘤甲基化领
域的“三驾马车”，他们共同推进了肿瘤 DNA 甲基化领域的研究。第⼀位就是我在美国博⼠后期
间的⽼板、约翰·霍普⾦斯⼤学 Andrew Feinberg 教授，他于 1983 年在 Nature 杂志发⽂揭⽰了
全基因组⽔平的低甲基化是肿瘤的重要特征，他是将 DNA 甲基化与肿瘤联系起来的第⼀⼈。但
有意思的是，他在这篇⽂章中说不清肿瘤的低甲基化是如何导致肿瘤的。两年后的 1985 年，约
翰·霍普⾦斯⼤学另⼀位著名的教授 Stephen Baylin 发现抑癌基因的启动⼦区域存在⾼甲基化，
进⽽阐明启动⼦区域⾼甲基化导致抑癌基因的低表达是肿瘤发⽣的重要原因。这就形成了⼀个
悖论，肿瘤的发⽣到底是因为 DNA 低甲基化还是⾼甲基化，⼀时间 DNA ⾼甲基化占据上风，
因为启动⼦区域的⾼甲基化导致抑癌基因的下调很好的符合了肿瘤发⽣的“⼆次打击”学说。对这
件事起到推波助澜作⽤的还有另⼀位肿瘤 DNA 甲基化领域的著名教授 Peter Jones，他于 1977
年发现核酸类似物 5-azacytidine (5-AzaC) 可以显著上调基因的表达，最后发现 5-Aza-C 主要与
DNA 去甲基化有关，⼤约在 1990 年前后基本上奠定了抑癌基因的⾼甲基化与肿瘤发⽣的稳定
关系，这逐渐形成了肿瘤领域的共识，推动了 DNA 去甲基化药物⽤于肿瘤。
尽管 DNA ⾼甲基化导致抑癌基因的下调已成为肿瘤领域的共识，但并⾮⽆懈可击：1）抑癌基
因有接近 1000 多个，但常研究的抑癌基因⼤约 50 个，那么⼤部分抑癌基因是怎样下调的呢？
启动⼦甲基化解释所有抑癌基因的下调显然⼒不从⼼。2）5-AzaC 是⼀个⼴谱的 DNA 甲基化抑
制剂，对抑癌基因的激活没有选择性，其肿瘤效果有限，如何激活抑癌基因就成了肿瘤领
域的⼀个“烫⼿⼭芋”，⼈⼈想吃，但⽆从下⼝。这就催⽣了⼀个重要的问题：启动⼦甲基化导致
抑癌基因下调是普遍规律吗？是否还有其他机制？是否能够基于这种机制，特异性地激活被抑
制的抑癌基因，为肿瘤带来新的曙光？
复旦⼤学于⽂强课题组⾃ 2009 年起致⼒于核内 miRNA 激活研究，提出 NamiRNA (Nuclear
activating miRNA) 通过增强⼦激活基因表达的全新理论。近⽇，复旦⼤学于⽂强课题组联合北
京中科院⽣态中⼼汪海林课题组以及复旦⼤学附属肿瘤医院李⼤强课题组，揭⽰了 NamiRNA-
增强⼦介导的抑癌基因的失活机制，并发现可通过NamiRNA-增强⼦⽹络可重新激活抑癌基因，
提⽰ NamiRNA-增强⼦可作为癌症的全新靶点。相关研究于 2021 年 7 ⽉ 30 ⽇在线发表在
Nucleic Acid Research 杂志（下⽂简称 NAR）杂志（图1）。
图 1. 相关⼯作发表在 2021 年 7 ⽉ 30 ⽇的 NAR
启动⼦⾼甲基化失活抑癌基因？
Not the Whole Picture!
DNA 甲基化能改变染⾊质结构和 DNA 构象与稳定性，启动⼦的 DNA 甲基化可以导致转录沉
默，进⽽引起基因的低表达或者失活(3)，如常见的抑癌基因 VHL (Von Hippel Lindau肿瘤抑制
因⼦)，p16INK4a (细胞周期蛋⽩依赖性激酶抑制剂2A[CDKN2A])，BRCA1 (乳腺癌易感性基因1) 和 hMLH1 (⼈类错配修复基因) 等在肿瘤中低表达是由于启动⼦区域⾼甲基化(4,5)。然⽽，对于 TSGene 数据库公布的 983 个肿瘤中低表达的抑癌基因(6,7)，抑癌基因低表达与启动⼦⾼甲基化关联的报道并不多。那么，其中有多少个基因的低表达是抑癌基因启动⼦甲基化引起的？抑癌基因在肿瘤中表达下调是否还有其他因素？本次研究通过系统的⽣信分析发现，乳腺癌中有 622 个抑癌基因，其中 383 个抑癌基因低表达。出乎意料的是，与正常对照组相⽐，乳腺癌中约 68% 低表达的抑癌基因启动⼦甲基化状态没有发⽣显著⾼甲基化（图2）。 图 2. 乳腺癌中低表达抑癌基因的启动⼦甲基化分析。秩和检验分析结果表明，和正常对照相⽐，乳腺癌中 68.2% 的低表达抑癌基因启动⼦没有⾼甲基化（红⾊框标注）。
NamiRNA-增强⼦-基因激活通路
The Neglected but Important Player!
既然在乳腺癌中启动⼦⾼甲基化⽆法解释抑癌基因的低表达现象，那么抑癌基因的表达受到哪些因素调控呢？鉴于增强⼦与启动⼦⼀样是顺式调控元件，本研究选取这 68% 没有甲基化差异的抑癌基因，
对它们的增强⼦标记 H3K27ac 在乳腺癌样本和正常对照中的富集进⾏了分析，结果显⽰有相当⼀部分抑癌基因（45/212）的增强⼦上 H3K27ac 在乳腺癌组织中的富集程度要显著低于正常对照组，提⽰增强⼦可能与乳腺癌中抑癌基因低表达相关。
miRNA 作为⼀种长度为 18~23 个核苷酸的⾮编码⼩ RNA，通常被认为在细胞质中通过结合靶基因的 3’-UTR 降解 mRNA 或抑制翻译从⽽发挥负向调控作⽤。随着miRNA 研究的不断深⼊和深度测序技术的发展，越来越多的证据表明，miRNA 不仅可定位于细胞质，⽽且也存在于其他细胞器中，miRNA 的不同细胞定位影响 miRNA 的功能(8)。
复旦⼤学于⽂强课题组专注于细胞核内 miRNA 研究⼗余年，在前期⼯作中对 ENCODE 数据库中 7 种不同细胞系 1594 条 miRNA 前体进⾏系统分析，发现 300 多条 miRNA 前体在基因组中的位置与增强⼦⾼度重叠，这些 miRNA 包括 hsa-miR-24、hsa-miR-3179 等；miR-3179 被证实能激活邻位基因 ABCC6 和 PKD1P1，miR-24-1 能激活靶基因 FBP1 和 FANCC 的表达(9)。这类 miRNA 定位于细胞核中并且通过靶向增强⼦进⽽激活临近或远端基因，这类细胞核内具有激活功能的 miRNA 定义为 NamiRNA (Nuclearactivating RNA)(9,10)。相关研究于 2017 年发表在 RNA Biology，Google Scholar 显⽰该⽂章⾄今被引 154 次。
图 3. NamiRNA 相关⼯作的原始⽂章
在肿瘤中，⼤量研究已经揭⽰了 miRNA 低表达与肿瘤发⽣发展的关联。miRNA 在肿瘤中低表达是肿瘤的另⼀个重要特征，很多 miRNA 在正常组织中的表达要⾼于肿瘤(11)。如 let-7 家族miRNA 可负向调控 MYC 及 RAS 家族癌基因的表达从⽽抑制肿瘤发展，且 let-7 家族 miRNA 在多种癌症中低表达并与不良预后相关(12,13)；肝脏细胞中 miR-199a 和 miR-199b 表达下调，与肝癌的发⽣发展有关(14)。另⼀⽅⾯，增强⼦是⼀类促进基因转录的 DNA 顺式调控元件，可近距离或远距离调控基因的表达，在细胞分化、组织发育、个体⽣长和肿瘤发⽣发展过程中发挥重要作⽤。H3K27ac 是激活状态增强⼦ (active enhancer) 的标记。增强⼦相关的染⾊质修饰异常引起抑癌基因的增强⼦失活或者癌基因增强⼦的异常激活都与肿瘤的发⽣有密切关系(15)。因此，本研究将 miRNA 和增强⼦两个重要的调控元件联系起来。
miR-339-增强⼦-GPER1 调控
Too Good to Be True
乳腺癌是全球发病率最⾼的癌症，也位列我国⼥性恶性肿瘤发病⾸位。三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer, TNBC) 具有⾼侵袭性、易转移的特点，⽬前尚⽆有效⼿段，因此寻新的靶点和有效药物迫在眉睫。
结合 NamiRNA-增强⼦-基因激活通路的研究(9)以及乳腺癌中增强⼦的异常，我们推测乳腺癌中可能存
在⼤量低表达的 NamiRNA，进⽽通过 NamiRNA-增强⼦通路，丧失了对抑癌基因的激活作⽤，最终导致了抑癌基因的低表达。
mirna靶基因分析⾸先我们分析得出乳腺癌中低表达的 NamiRNA 候选基因，通过 mRNA-seq 分析（图4）以及绝对定量 PCR 实验验证，优先筛选出在乳腺癌中低表达的 miR-339 和靶向激活的抑癌基因GPER1 作为研究对象。
图 4. mRNA-seq 分析在乳腺癌细胞 4175 中过表达 miR-339 激活的基因，其中包含GPER1
有意思的是，GPER1 是同⼀条染⾊体（Chr7）上距离 miR-339 最近的抑癌基因，在UCSC Genome Browser ⾥可以查到 miR-339 就在 GPER1上游 60kb 的位置，并且 ENCODE 数据也显⽰ miR-339 的基因座位置的 H3K27ac 富集（图5）。
图 5. UCSC 上 miR-339 和 GPER1 在 7 号染⾊体上的位置。UCSC 截图显⽰ ENCODE 数据中miR-339 位置有显著的 H3K27ac 富集，提⽰ miR-339 和增强⼦位置重叠，其中不同的颜⾊代表不同的细胞类型。
为了进⼀步验证，本研究收集了 157 对不同分⼦分型的乳腺癌组织（Luminal A，Luminal
B，HER2 富集型和三阴性乳腺癌）及相应的癌旁对照组织进⾏了 RT-qPCR 检测，结果表明与对照组
织相⽐，miR-339 和抑癌基因 GPER1 在 Luminal 型及三阴性乳腺癌组织中表达下调，⽽在 HER2 富集型乳腺癌组织中没有明显差异（图6）。同时，miR-339 可作为乳腺癌潜在的分类标记，对于 miR-339 低表达的乳腺癌患者，通过 miR-339 再激活 GPER1，有可能带来福⾳。
图 6. 不同类型乳腺癌组织中 miR-339 和 GPER1 表达情况和相关关系
那么，miR-339 和抑癌基因 GPER1 对乳腺癌细胞⾏为学会产⽣怎样的影响呢？⾸先，在Luminal 乳腺癌细胞系 T47D 和三阴性乳腺癌细胞系 4175 中过表达外源性 miR-339，结果提⽰在这两个⾮ HER2 富集型乳腺癌细胞中过表达 miR-339 后抑癌基因 GPER1 的表达均被激活，并且它们的增殖和克隆形成能⼒均受到明显抑制，表明过表达 miR-339 可再激活（reactivate）抑癌基因 GPER1，进⽽抑制乳腺癌细胞⽣长及增殖；也提⽰ miR-339 可以作为三阴性乳腺癌的提供潜在的靶点（图7）。
图7. miR-339 过表达可重新激活抑癌基因 GPER1 并抑制乳腺癌细胞⽣长和增殖
此外，机制研究上，本研究通过双荧光素报告基因实验证明了 miR-339 locus 具有增强⼦活性；ChIP-seq 结果表明过表达 miR-339 可以提⾼靶基因增强⼦活性（图8）；另⼀⽅⾯，利⽤CRISPR/Cas9 敲除技术破坏增强⼦序列完整性后，miR-339 不能再激活 GPER1（图9）。增强⼦就像开关⼀样，过表达 NamiRNA 会提⾼增强⼦活性，打开促进靶基因表达的开关；反之，NamiRNA 低表达就会降低增强
⼦活性，关闭促进靶基因表达的开关。
图 8. ChIP ⾼通量测序分析。过表达 miR-339 可以激活增强⼦活性，ChIP-seq 分析过表达miR-339 后，miR-339 DNA locus 位置附近 H3K27ac 富集明显⾼于对照组。
图 9. CRISPR 系统破坏增强⼦完整性后，过表达 miR-339 不能激活 GPER1
NamiRNA激活沉默的抑癌基因潜⼒⽆限
Too Simple but Powerful!
为了探究过表达 miR-339 再激活 GPER1 是否可以对乳腺癌细胞发挥抑制作⽤，我们进⾏了动物荷瘤实验。结果表明，过表达 miR-339 可以抑制乳腺癌发展与增殖，提⽰ miR-339 是乳腺癌潜在的靶点，可为乳腺癌提供新的线索和思路（图10）。
图10. 动物荷瘤实验。NamiRNA 作⽤不仅有效⽽且特异性，提⽰ NamiRNA 做为⼩核酸药物的巨⼤潜⼒
NamiRNA不怕做不到，就怕想不到
图 11. 在正常和肿瘤细胞中 miR-339-增强⼦介导的抑癌基因 GPER1 的活性
本研究阐明了抑癌基因在肿瘤中的低表达与增强⼦及 miRNA 的异常调控有关。本次⼯作在分⼦机制上对 miR-339 通过增强⼦靶向激活抑癌基因 GPER1 进⾏了较为详细的阐述。此外，乳腺癌中抑癌基因 GPER1 低表达与 miR-339 低表达有关，细胞⾏为学实验及动物实验结果均表明过表达 miR-339 后可再激活抑癌基因 GPER1 进⽽抑制乳腺癌细胞的⽣长与增殖，提⽰ miR-339 可为乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌提供潜在的靶点和策略。
后记
NamiRNA 研究开展 10 年多，由最初的假说到实验验证，实验室的学⽣⾛了⼀波⼜⼀波，套⽤我们实验室学⽣的话说，在 NamiRNA 研究的星⾠⼤海中，谁信不重要，⾃⼰信最重要。NamiRNA 研究已经成为我们实验室重要的研究⽅向，先后有 10 余⼈投⼊其中，涉及NamiRNA 作⽤机制、重要表观遗传现象的另类解释、疾病新策略、重要传染性疾病新的预防⽅案等。我们深知⼀个全新的研究⽅向要得到科学共同体的认可需要时间，对科学研究者来说，我们坚信科学真理不是⽤来膜拜的，⽽是⽤来颠覆和超越的，只要⽅向对了，到达胜利的终点只是时间问题。这世界本没有路，总得有⼈去披荆斩棘。感谢汪海林⽼师、李⼤强⽼师，相信本⾝就是⼀种⽆穷的⼒量。昨天我们孤独前⾏，今天我们结伴⽽⾏，明天我们将⼀起⼤步前⾏！
撰⽂：梁英、徐鹏、于⽂强。⽂中“我”为于⽂强教授。
参考⽂献：
1. Macleod, K. (2000) Tumor suppressor genes. Curr Opin Genet Dev, 10, 81-93.
2. Sherr, C.J. (2004)Principles of tumor suppression. Cell,116, 235-246.
3. Skvortsova, K., Stirzaker, C. and Taberlay, P. (2019) The DNA methylation landscape in cancer. Essays Biochem, 63, 797-811.
4. Esteller and Manel. (2002) CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a booming present, a brighter future. Oncogene,21, 5427-5440.
5. Esteller, M.(2007) Epigenetic gene silencing in cancer: the DNA hypermethylome. Human Mol Genet, 16 Spec No 1, R50-59.
6. Zhao, M., Kim, P., Mitra, R., Zhao, J. and Zhao, Z. (2016) TSGene 2.0: an updated literature-based knowledgebase for tumor suppressor genes. Nucleic Acids Res, 44, D1023-1031.
7. Zhao, M., Sun, J.and Zhao, Z. (2013) TSGene: a web resource for tumor suppressor genes. Nucleic Acids Res, 41, D970-976.
8. Thurman, R.E., Rynes, E., Humbert, R., Vierstra, J., Maurano, M.T., Haugen, E., Sheffield, N.C., Stergachis, A.B., Wang, H., Vernot, B. et al. (2012) The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature, 489, 75-82.
9. Xiao, M., Li, J., Li, W., Wang, Y., Wu, F.Z., Xi, Y.P., Zhang, L., Ding, C., Luo, H.B., Li, Y. et al. (2017) MicroRNAs activate gene transcription epigenetically as an enhancer trigger. RNA Biol, 14, 1326-1334.
10. Liang, Y., Zou, Q. and Yu, W. (2017) Steering Against Wind: A New Network of NamiRNAs and Enhancers. Genomics Proteomics Bioinformatics, 15, 331-337.
11. Lu, J., Getz, G.,Miska, E.A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., Sweet-Cordero,
A.,Ebert,
B.L., Mak, R.H., Ferrando, A.A. et al. (2005) MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature, 435, 834-838.
12. Barault, L., Amatu, A., Bleeker, F.E., Moutinho, C., Falcomata, C., Fiano, V., Cassingena,
A., Siravegna, G., Milione, M., Cassoni, P. et al. (2015) Digital PCR quantification of MGMT
methylation refines prediction of clinical benefit from alkylating agents in glioblastoma and metastatic colorectal cancer. Ann Oncol, 26, 1994-1999.
13. Akao, Y., Nakagawa, Y. and Naoe, T. (2006) let-7 microRNA functions as a potential growth suppressor in human colon cancer cells. Biol Pharm Bull, 29, 903-906.
14. Preusse, M., Theis,F.J. and Mueller, N.S. (2016) miTALOS v2: Analyzing Tissue Specific microRNA Function. PLoS One, 11, e0151771.
15. Sur, I. and Taipale, J. (2016) The role of enhancers in cancer. Nat Rev Cancer, 16,483-493.
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