BD SMART™ RACE cDNA Amplificatin Kit User Manual
Table f Cntents
I. 简要概述
II. 成分列表
Cntrl Human PlacentalTtal RNA 和BD SMART II A lignucletide在–70°C下保存。
NucleTrap Gel Extractin Kit 室温下保存。
其余试剂–20°C下保存。
随BD SMART RACE cDNA Amplificatin Kit 同时免费提供BD PwerScript Reverse Transcriptase和BD Advantage 2 PCR Kit。所有试剂可以满足7 次cDNA 合成反应和30次PCR反应。
First-strand cDNA 合成
•7µl BD SMART II™ A lignucletide (12 µM)
5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'
• 7µl 3'-RACE CDS Primer A (3'-CDS; 12 µM)
5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N–3'
(N = A, C, G, r T; V = A, G, r C)
• 7µl5'-RACE CDS Primer (5'-CDS; 12 µM)
5'–(T)25V N–3' (N = A, C, G, r T; V = A, G, r C)
• 7µl BD PwerScript™ Reverse Transcriptase
• 200 µl 5X First-Strand Buffer
250 mM Tris-HCl (pH 8.3)
375 mM KCl
30 mM MgCl2
• 200 µl Dithithreitl (DTT; 20 mM)
• 1ml Deinized H2
5'- & 3'-RACE PCR
• 400 µl 10X Universal Primer A Mix (UPM)
Lng (0.4 µM):
5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3' Shrt (2 µM):
5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3'
• 50 µl Nested Universal Primer A (NUP; 10 µM)
5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'
Cntrl Reagents
• 5µl Cntrl Human Placental Ttal RNA (1 µg/µl)
• 25 µl Cntrl 5'-RACE TFR Primer (10 µM)
• 25 µl Cntrl 3'-RACE TFR Primer (10 µM)
General Reagents
• 70 µl dNTP Mix (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, each at 10 mM)
• 2 X 1 ml Tricine-EDTA Buffer
10 mM Tricine-KH (pH 8.5)
1.0 mM EDTA
Nucle Trap® Gel Extractin Kit (Cat. N. 636053 r K3070-y)
• 100 µl NucleTrap Suspensin
• 3 ml NT1 Buffer
• 10 ml NT2 Buffer
• 2ml NT3 Buffer
• User Manual (PT3169-1)
Free trial-size BD Advantage™ 2 PCR Kit (Cat. N. 639207 r K1910-y)
The BD Advantage 2 kit prvides sufficient reagents fr 30 PCR reactins.
The fllwing cmpnents are included:
• 30 µl50X BD Advantage 2 Plymerase Mix
• 200 µl10X BD Advantage 2 PCR Buffer
• 50 µl 50X dNTP Mix (10 mM each)
• 30 µl Cntrl DNA Template (100 ng/µl)
• 30 µl Cntrl Primer Mix (10 µM each)
• 1 ml PCR-Grade Water
• User Manual (PT3281-1)
III. 另备物品
下列试剂需另外准备：
• 0.5-ml PCR 反应管，推荐使用PerkinElmer GeneAmp 0.5-ml reactin tubes (Cat. N. N801-0737 r N801-0180). race实验• Mineral il (e.g., Sigma Cat. N. M-3516)
IV. BD SMART RACE的要点
使用前请全面阅读
•所有参数均经过优化，但可能因所使用的酶、模版、引物和热循环仪而不同。因此应使用Cntrl Human Placental Ttal RNA和Cntrl 5'- and 3'- RACE TFR Primers进行预实验。 •RACE PCR的效率取决于试验样品RNA中mRNA的丰度。另外退火温度和延伸温度也依引物不同而变化。请参照第X节的建议优化PCR的条件。
•在进行5'-RACE and 3'-RACE PCR时必须使用热启动。本手册已经过优化，所使用的BD Advantage 2 Plymerase Mix中包含BD TaqStart 抗体用于自动进行PCR的热启动(Kellgg et al., 1994)。也可以手动(D’Aquila et al., 1991).或使用蜡珠(Chu et al., 1992)来进行热启动。
•推荐使用试剂盒中提供的Tricine-EDTA缓冲液稀释和重悬DNA样品。Tricine缓冲液在高温下较Tris-based缓冲液有更好的缓冲能力。Trisbased 缓冲液会导致pH降低，引起DNA的降解。
•整个过程要戴手套以防核酸酶污染。
• 重悬过程（包括吸入和吹出溶液）要轻缓，短暂离心使所有成分聚集管底。
• 无特别标示，所有操作均应在冰上进行。
• 聚合酶在最后加入。
• 使用推荐的酶加入量，该量已经过特别的优化。
• EB是致癌物质，小心处理和使用。
V. 引物设计
A. 引物序列
特异引物(GSPs) 应当：
• 23–28 个核苷酸
• GC含量为50–70%
• Tm 大于或等于65°C，如果Tm >70°C可获得最好的结果(可使用降落PCR)。
模版、引物及RACE产物如图3所示。至少需要两个特异引物才能进行完整的BD SMART RACE：即用于5'-RACE PCR的反义引物和用于3'-RACE PCR的正义引物。如果只进行5'- 或3'-RACE则只需一个特异引物。引物长度在23–28个核苷酸，长于30个核苷酸没有优势。 如图3所示，两种引物的5'- and 3'-RACE扩增产物存在部分重叠，如果在重叠区有一个合适的限制性酶切位点，可以通过酶切和连接反应可以得到cDNA的全长。将两个引物设计成其RACE产物有100–200-bp的重叠的形式，就能够配合使用作为PCR反应的阳性对照。引物并非一定要设计成获得重叠片断的形式。对于大或稀有cDNAs，引物最好要设计的尽量靠近cDNA的末端，不产生重叠。此外，引物自身可以重叠（如互补）。 特异引物GC含量为50–70% ，其至少65°C。使用nearest neighbr 分析(Freier et al., 1986; 我们使用Primer Premier软件来计算Tm’s) Tm.应尽可能大于70°C。根据我们的经验，长引物的退火温度高于70°C 特别从困难的样品中可以得到强的RACE扩增。Tm’s 超过70°C 可以使用降落PCR。此外GSP1和GSP2设计成具有相似的Tm’将更有利于使用。通过计算或试验能够得到GSP1和GSP2的Tm’s。要避免使用内部互补的引物或引物之间互补的引物，尤其在引物的3'末端互补。
注意：不要将酶切位点都合并到5'和3'特异引物的5'末端，根据我们的经验，这些额外的序列将会增加
反应的背景。
Figure 3. The relatinship f gene-specific primers t the cDNA template.
B. 引物在基因上的位置
尽管我们使用BD SMART RACE Kit成功地得到了大于6.5 kb扩增产物，但为了使你的5'-和3'-RACE 产物达到2 kb，建议对引物加以筛选。
C. 降落PCR
我们发现降落PCR (Dn et al., 1991; Rux, 1995)明显增加BD SMART RACE扩增的特异性。降落PCR的
退火温度符合首次PCR循环的Tm 高于通用引物的Tm 。如果你的特异引物Tm，在这些循环中将只有与基因特异性结合的引物发生聚合，从而积累一定量的特定产物。退火温度在随后降低到与通用引物相配合的程度，引起特异性基因模版的指数和高效率的扩增。
当你的引物的T m>70°C时我们推荐使用降落循环程序。
在首次试验时，不要使用巢式PCR。混合的通用引物（UPM）和基因特异引物（GSP）通常能得到较好的低的非特异性背景的RACE产物。但是，巢式特异引物可以作为探针在鉴定RACE产物的Suthern bltting中使用。此外巢式PCR在使用特异引物进行5'- r 3'-RACE存在高背景或高非特异性扩增时有必要使用。在巢式PCR中，使用外侧引物进行一个初步的扩增，如果扩增产物模糊不清，可以使用内部引物重新扩增初步产物的一部分。BD SMART RACE 指南包括了可选的步骤，指明了巢式引物能够被使用的地方。本试剂盒提供的通用巢式引物A 可用于5'- and 3'-RACE。按照上述指南可以设计巢式特异引物。巢式引物与外侧特异引物尽可能不重叠，如果因序列有限而必须重叠，其内部引物的3'末端的序列也要尽可能唯一。
VI.总RNA 和Ply A+ RNA的制备
A. 总的预防
影响cDNA合成质量的首要因素就是总RNA和ply A+ RNA的完整度和纯度。下述预防措施可使你避免RNA的降解和污染。
• 戴手套
• 直接使用新鲜去离子水，没有用DEPC 处理。.
• 用0.5 N NaH漂洗所有的玻璃器皿，160–180°C烘烤4–9 hr.
• 使用一次性吸管吸头.
B. RNA 分离
BD Bisciences Clntech 提供几种试剂盒用于RNA分离和纯化，如NucleBnd® RNA/DNA Mini Kit (Cat. N. 635945)。
C. RNA 分析
推荐使用变性甲醛琼脂糖电泳检测RNA 样品。哺乳动物的总RNA 展示为两条4.5 和1.9 kb的带，分别对应28S 和18S 核糖体RNA，它们之间的亮度比率约为1–2:1。哺乳动物的Ply A+ RNA 会产生0.5–12
kb 的弥散带，亮度较核糖体RNA带弱。Size distributin may be smaller with nnmammalian tissue surces.
VII. cDNA 的第一链合成
如下所述，两个10-µl的反应可以将50 ng–1 µg 总RNA 或ply A+RNA转换成用于RACE的cDNA的
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议