基于Miseq高通量测序技术的辣椒酱核心细菌类研究 沈馨;王艳;代凯文;尚雪娇;董蕴;郭壮
【摘 要】在采用Miseq高通量测序技术对6个辣椒酱细菌微生物多样性进行解析的基础上,进一步使用电子舌对辣椒酱的滋味品质进行评价,探讨核心细菌类对辣椒酱滋味品质的影响.结果表明,芽孢杆菌(Bacillus)和葡萄球菌(Staphylococcus)是湖北当阳地区辣椒酱中的优势细菌微生物,其相对含量分别为37.62 %和20.66 %.在分类操作单元(operational taxonomic units,OTU)水平上发现14个核心OTU,其中分别有5个和3个OTU隶属于芽孢杆菌(Bacillus)和葡萄球菌s(Staphylococcu).酸味是辣椒酱样品间差异最大的滋味指标,微生物构成对辣椒酱滋味品质的形成具有较大的影响.%To investigate the core bacterial diversity of chilli sauce, and evaluated their functions on taste quality of samples, the core bacterial microbiota of 6 samples were revealed by Miseq high throughput sequencing technologies,and taste quality of these samples were determined using electronic tongue.Bacillus and Staphylococcus were the dominant bacteria genera in chilli sauce samples with the relatively abundant of 37.62 % and 20.66 %,respectively.At the OTU level,we found 14 OT Us shared by all samples,5 OTUs and 3 OTUs were belonged to Bacillus and Staphylococcus. Sourness was the most significant difference taste quality,and the relative abundance of core bacterial genera had greater impact on the taste quality formation of chilli sauce.
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2018(039)010
【总页数】7页(P151-157)
【关键词】辣椒酱;Miseq高通量测序技术;细菌;电子舌;滋味
【作 者】沈馨;王艳;代凯文;尚雪娇;董蕴;郭壮
【作者单位】湖北文理学院化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳441053;当阳市妇幼保健院 检验科,湖北宜昌444100;当阳市食品药品监督管理局,湖北宜昌444100;湖北文理学院化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳44105
3;湖北文理学院化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳441053;湖北文理学院化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳441053
【正文语种】中 文
辣椒酱是以破碎的鲜辣椒或干辣椒为原料，经发酵或非发酵加工制作而成的一种调味品，因具有促进食欲和健脾开胃的功效而深受消费者喜爱[1]。传统的辣椒酱主要依靠辣椒自带或环境中的乳酸菌自然发酵而成，制作工艺相对简单，发酵周期也较长[2]。众所周知，传统发酵食品制作环境相对开放，基质中微生物的多样性亦相对较高，不仅蕴含对产品品质形成具有积极意义或具有潜在益生特性的菌株，亦可能含有一些致病菌或条件致病菌[3]。然而令人遗憾的是，目前关于辣椒酱细菌微生物多样性研究的报道尚少。
近年来以Miseq为代表的第二代高通量测序技术，采用宏基因组学的研究策略，不仅全面揭示了传统发酵食品中微生物的落结构，同时亦实现了微生物多样性与产品品质的关联分析[4]，目前在葡萄酒[5]、腊肠[6]、泡菜[7]和窖泥[8]等微生物多样性研究中有了广泛的应用，这为解析辣椒酱中细菌微生物的多样性提供了新的技术手段。作为产品品质的重要组成部分，滋味品质直接决定了消费者对辣椒酱产品的喜好程度。相对于感官鉴评方法，电
子舌技术实现了酱类制品中酸、苦、涩、鲜和咸5个基本味及苦、涩和鲜味3个基本味回味的数字化评价，具有对试验人员专业技能要求低且受外界影响小的优点[9]。
在采用Miseq高通量测序技术对辣椒酱中细菌微生物多样性进行揭示的基础上，本研究进一步使用电子舌这一仿生设备对产品的滋味品质进行了评价，同时探讨了核心细菌类对辣椒酱品质的影响，以期为后续辣椒酱中优势菌株的分离及产品的产业化生产提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
样品采集：从湖北省当阳市草埠湖镇和玉泉办事处的6个农户家中，各采集1个自制辣椒酱样品，每个样品分别采集200 g左右，置于含有冰袋的采样箱中进行DNA提取。
firmicutes
5×TransStartTM FastPfu Buffer、dNTPs Mix、FastPfu Fly DNA Polymerase：北京全式金生物技术有限公司；E.Z.N.A.®Soil DNA Kit试剂盒：美国OMEGA公司；阴离子溶液、阳离子溶液、味觉标准溶液、内部溶液和参比溶液：日本Insent公司。
1.2 仪器与设备
5810R台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；ND-2000C微量紫外分光光度计：美国Nano Drop公司；DYY-12电泳仪：北京六一仪器厂；UVPCDS8000凝胶成像分析系统：美国BIO-R AD公司；vetiri梯度基因扩增仪：美国AB公司；Miseq高通量测序平台：美国Illumina公司；R 920机架式服务器：美国DELL公司；SA 402B电子舌（配备 AAE、CT0、CA0、AE1和 C00测试传感器）：日本Insent公司。
1.3 试验方法
1.3.1 DNA提取
取10 g辣椒酱加入40 mL蒸馏水，300 r/min离心10 min后取上清，继而10 000 r/min离心10 min后取沉淀，采用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit试剂盒进行微生物宏基因组DNA提取。
1.3.2 细菌16S rR NA序列V4-V5区扩增及扩增体系 DNA模板10 ng，5 μmol/L正向和反向引物各0.8 μL，5U/μLDNA 聚合酶0.4μL，2.5mmol/L
dNTPsmix 2μL，5×PCR缓冲液4μL，体系用 ddH2O 补充至 20 μL。其中：正向引物为338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）， 反 向 引 物 为 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），在正向引物前端加入7个核苷酸标签（barcode），以便进行生物信息学分析时将序列划分到各个样品。扩增条件：95℃变性3 min；95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，35个循环；72℃延伸10 min。
1.3.3 高通量测序及序列质控
PCR产物置于干冰中冷链寄往上海美吉生物医药科技有限公司，使用Miseq高通量测序平台进行测序。数据下机后，首先将双端序列拼接成一条序列，继而根据barcode信息将拼接好的序列划分到各样品并进行序列方向校正，然后去除序列中的barcode和引物，最后将6个样品的序列归并为1个fna文件进行后续生物信息学分析。值得一提的是，若在拼接过程中成对序列的重叠区小于10 bp或最大错配比率大于0.2、有barcode碱基错配或引物碱基错配数大于2 bp及切除barcode和引物后序列长度小于50 bp，则相对应的序列均予以剔除。
1.3.4 生物信息学分析
将质控后的序列文件导入QIIME（v1.7.0）[10]进行分析，首先调用PyNAST[11]软件将所有序列对齐；其次采用UCLUST算法[12]进行序列划分并建立分类操作单元（Operational taxonomic units，OTU），若某一 OTU 在所有样品中均存在则将其定义为核心OTU；然后使用ChimeraSlayer[13]进行嵌合体去除；继而挑选OTU中的代表性序列同时使用R DP（ribosomal database project，R elease 11.5）[14]和 Greengenes（R elease 13.8）[15]数据库明确OTU分类学地位，若某一门或属在所有样品中均存在，则将其定义为核心门或属；接着使用FastTree软件[16]绘制代表性序列系统发育进化树，并在此基础上计算α多样性指数—香农指数（Shannon index）、超1指数（Chao1 index）和发现物种数，进而绘制稀疏曲线图和香农指数曲线。
1.3.5 核酸登录号
本研究中所有Miseq高通量测序数据均已提交至MG-RAST数据库，ID号为mgp336604。
1.3.6 辣椒酱样品的滋味品质分析
取20.0 g辣椒酱用180 mL蒸馏水4℃浸泡过夜后，3 000 r/min离心10 min后取上清备用。传
感器活化、清洗后，首先在参比溶液中测得电势值Vr；其次在样品中测得电势 Vs，C00、AE1、CA0、CT0 和 AAE 5 个传感器对应的Vs-Vr值即为样品酸、苦、涩、咸和鲜味等5个基本味的相对强度值；再次洗涤后，C00、AE1和AAE 3个传感器分别在参比溶液中测得电势Vr’，Vr’-Vr值为辣椒酱后味A（涩的回味）、后味B（苦的回味）和丰度（鲜的回味）的相对强度值。
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