微⽣物影响机制探究通常将核⼼讨论点聚焦于“物种”，总是倾向于到某⼀个或⼏个物种与分组差异的关联，采⽤统计检验、LEfSe、随机森林、ROC、Indicator等各种指⽰物种研究⽅法。 但是细想，分组差异不⼀定是⼀个、⼏个物种的决定性作⽤，有可能是落整体的影响。肠型分析就是这种站在落整体⾓度，探究分组差异的研究思路，更侧重于分析样本落特征（即肠型类别）与分组差异的关联。 “肠型”最初是学者在⼤样本量⼈肠道微⽣物研究过程中，对样本肠道微⽣物特征的分类[1] ，后来在很多研究中都被证实存在肠型[2] ，还发现肠型类型可能跟疾病等表型有⼀定的关联特征，可以辅助分析物种与宿主的关联机制。所以肠型鉴定在⼈、⼩⿏肠道微⽣物中有⼴泛应⽤，但后续也逐渐推⼴到其他动物研究中。
什么是肠型呢？⼀开始听到这个概念，可能都会有⼀个误区，以为肠型是对某个样本进⾏鉴定，判断该样本属于哪种肠型。但实际上，肠型分析是对所有样本进⾏聚类，把样本分成不同类别后，判断每个类别是否符合某种肠型，也有可能都不符合。⽬前主流的是基于数据库鉴定了三种肠型，也有研究提出四种肠型[2] 。我们以三种肠型的分析⽅法为例和⼤家分享。
分析步骤
1）计算距离矩阵：最常⽤的是选择属⽔平相对丰度（也有⽂章选择科等其他⽔平），计算样本间Jensen-Shannon divergence（JSD）距离。
2）选择最佳cluster数⽬：计算Calinski–Harabasz（CH）index（图1），选择CH值最⾼时对应的K值，即为样本分类数（cluster的数量），通常在2到4之间⽐较好。
图1 CH index
3）样本聚类：基于Partitioning Around Medoids算法，R语⾔cluster包，将样本按预定数量进⾏分类，然后绘制PCoA 等图形，按分类结果给定分组颜⾊（图2）。
4）样本聚类质量评估：计算样本silhouette value，值越⾼样本越符合聚类结果。
图2 样本聚类结果
肠型鉴定
以⼈、⿏为例，有3种肠型特征，Bacteroides（拟杆菌）是肠型1（enterotype 1，ET B）最好的指⽰类；肠型
2（enterotype 2，ET P）是由Prevotella（普⽒菌）驱动；肠型3（enterotype 3，ET F）是通过Firmicutes（厚壁菌）占⽐⾼低来区分的，其中最主要的类为Ruminococcus（瘤胃球菌）。
肠型分类通常基于属⽔平进⾏，因为属⽔平可以更好的反映⽣态位变化。基于样本的聚类特征，设定
分组，统计⽬标物种在组间的丰度差异，结合盒型图、⼩提琴图等可视化展⽰，基于肠型标志物种判断cluster的类型（图3）。
图3 标记物种丰度统计
肠型应⽤
对婴⼉肠道微⽣物的⼲扰会影响免疫系统的发育、过敏性疾病的风险。研究结合饮⾷类型，探讨肠道菌在特应性⽪炎（AD）患者中的作⽤。采集健康婴幼⼉20例，AD患⼉20例宏基因组测序[3] 。如图4，样本最佳聚类分为2个cluster，绿⾊和红⾊，并使⽤盒型图展⽰红⾊cluster特征物种丰度，绿⾊cluster特征物种丰度。
图4 肠型分析
firmicutes
Tips
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参考⽂献
[1] Arumugam, M., Raes, J., Pelletier, E., Le Paslier, D., Yamada, T., Mende, D. R., Fernandes, G. R., Tap, J., Bruls, T., Batto, J. M., Bertalan, M., Borruel, N., Casellas, F., Fernandez, L., Gautier, L., Hansen, T., Hattori, M., Hayashi, T., Kleerebezem, M., Kurokawa, K., … Bork, P. (2011). Enterotypes of the human gut microbiome. Nature, 473(7346), 174–180.
[2] Costea PI, Hildebrand F, Arumugam M, et al. Enterotypes in the landscape of gut microbial community composition [published correction appears in Nat Microbiol. 2018 Feb 13]. Nat Microbiol. 2018;3(1):8-16.
[3] Lee MJ, Kang MJ, Lee SY, et al. Perturbations of gut microbiome genes in infants with atopic dermatitis according to feeding type. J Allergy Clin Immunol. 2018;141(4):1310-1319.
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