一种新型土壤改良微生物菌剂及制备方法和应用

1.本发明涉及肥料技术领域，具体涉及新型土壤改良微生物菌剂及制备方法和应用。

背景技术：

2.土壤退化是自然或人为过程导致土壤的物理、化学或生物特性丧失，导致重要的生态系统功能减少或消失。随着气候变化和人类活动的干扰，土壤退化问题日益突显。土壤退化可以导致土壤质量的恶化，造成水土流失、土地贫瘠化、沙化、盐碱化、土壤污染等。加强植被覆盖是防御土壤退化的有效措施，然而由于土壤退化造就的恶劣土壤环境，植被很难在其上健康生长，有时甚至导致植被大量死亡，使植物恢复手段无法顺利实施。微生物是土壤生态系统的重要组成部分，直接或间接地参与所有土壤生态过程，在陆地生态系统物质循环、能量转换中发挥着重要作用，在退化土壤恢复中发挥重要作用。土壤微生物组也是生物圈中最具生物多样性的落，至少拥有地球总生物多样性的四分之一。然而，与健康土壤相比，退化土壤生态系统中微生物的数量和种类均极大降低，且大多数微生物以休眠体形式存在，不进行生长代谢，因而不能发挥微生物的生态功能。
3.人工添加功能微生物是一种行之有效地增加土壤微生物量，并可能实现退化土壤恢复的方法。这些功能微生物主要来源于植物根际，被称为植物根际促生菌（plantgrowth promoting rhizobacterium，简称pgpr），它们对植物的有益作用主要通过生物固氮、解磷解钾、分泌有机酸、产生植物激素、铁载体、acc脱氨酶等，从而促进植物生长、提高养分吸收利用、预防植物病害。pgpr还有助于增强植物对非生物胁迫（如重金属、干旱、高盐碱）的抵抗性，稳定土壤团聚体，改善土壤结构以及提供有机质含量。目前市场销售的prpg菌剂产品多为单株微生物构成，在实际应用时往往存在效果不稳定和不理想等问题，一方面是因为单一菌株无法适应复杂的土壤环境，另一方面单株菌一般很难获得全面的植物益生作用。研究表明，利用混合不同菌株的“合成菌”可以解决单菌所表现出的这种大田效果不佳的问题，其原因在于合成菌包含不同促生特性和功能冗余的菌株体，不同的菌株组合在一起可以彼此互补、协调共生。
4.有研究表明，有机调理剂处理土壤后，能显著增加土壤和根际各种微生物的数量和种类，微生物区系组成更加复杂，甚至改变根际微生物的优势种，促进有益微生物增殖，同时对于培肥地力、改善土壤结构、提高作物产量和品质以及防治植物土传病害方面也发挥了重要作用。园林绿化废弃物和污泥是富含碳源和氮磷营养元素的有机物，也是城市固体废弃物的主要来源，随着人们生活水平提高，以及城市绿化面积的不断增加，两类废弃物的数量也逐年递增。以北京为例，每年园林绿化废弃物总量超过500 万吨，而销纳处置能力不足10%；城市污泥量每年约110万吨，并以15％的速度增长，约有70%的污泥缺乏有效出路。如何科学、合理处置这些废弃物，在不污染环境的前提下使其变废弃为宝，对于科研工作者来说是亟待解决的问题。

技术实现要素：

5.由于退化土壤的恶劣条件不利于微生物的定殖和生长，结合有机调理剂的施用，有可能在改善土壤环境的同时，促进功能微生物的生长繁殖和存活。基于此，本发明将含有不同功能的多种微生物构建合成菌，与园林绿化废弃物和城市污泥配制的有机调理剂组合，在实现废弃物资源高效利用的同时，将有机调理剂与微生物菌混合制备微生物菌剂，发挥微生物菌剂的土壤改良和修复功能，用于土壤改良。既解决园林绿化废弃物和城市污泥合理的资源化利用，又稳定微生物菌种活性和功能，并实现退化土壤的改良效果。
6.本发明提供的技术方案是：一种土壤改良微生物菌剂的制备方法，其包括如下步骤：将污泥与园林废弃物按1:1至1:3比例混合，在其中添加多种微生物构建合成菌，所述菌包括具有解磷、解钾、固氮、产iaa、铁载体、acc脱氨酶、拮抗病原菌功能的多种菌。
7.具体地，所述菌包括假单胞菌（pseudomonas sp.）、寡养单胞菌（stenotrophomonassp）、耐盐芽孢杆菌（bacillus halotolerans）、暹罗芽孢杆菌（bacillus siamensis），与日本曲霉（aspergillus japonicus）或草酸青霉（penicillium oxalicum）组合构建合成菌；优选地，假单胞菌、寡养单胞菌的保藏编号分别为cgmcc no.12894、cgmcc no.12897；耐盐芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌的保藏编号分别为cgmcc no. 19502、cgmcc no. 19505；日本曲霉、草酸青霉的保藏编号分别为cgmcc no. 7700、cgmcc no. 7699。
8.另外优选的实施方式中，所述园林绿化废弃物是乔木、灌木修剪枝条和林下枯落物或杂草，经粉碎机粉碎至长度3cm以下；所述污泥是污水处理厂城市污泥，经高级厌氧消化，更多的是，所述高级厌氧消化过程：普通城市污泥输送至高级厌氧消化的料仓，然后被输送至热水解单元中，在165℃条件下水解约30min，经闪蒸破壁后，污泥被输入至中温厌氧消化单元处理进行厌氧消化处理，经约18d-20d 厌氧消化后进入板框脱水单元进行污泥深度脱水）。
9.在具体实施方式中，取所述园林绿化废弃物与污泥按比例混合堆肥腐熟后，自然风干并用粉碎机将其粉碎，过10目的筛子，经高压灭菌后冷却得到堆肥腐熟产品，加入所述菌得到土壤改良微生物菌剂。
10.优选地，所述堆肥腐熟的方法是，按比例取园林绿化废弃物与污泥，添加堆肥腐熟剂（优选地添加量为堆肥原料重量的0.1%-0.3%），保证物料含水量为50%-55%，用堆肥袋进行堆制，在堆肥过程中确保堆体中氧气充足。
11.更优选地，在堆肥过程中为确保堆体中氧气充足是采用翻堆的方式，优选每5-6天翻堆一次。
12.在具体实施方式中，取培养好的假单胞菌、寡养单胞菌、耐盐芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌进行混合培养得细菌混合菌剂，将所述混合菌剂和所述日本曲霉菌液分别喷洒在所述堆肥腐熟产品表面，即得土壤改良微生物菌剂。
13.优选地，所述细菌混合菌剂中的活菌数为3
×
10
9 cfu/ml-4
×
10
9 cfu/ml菌液，所述日本曲霉菌液每毫升的孢子量为6
×
109个-8
×
109个。
14.本发明还提供所述的方法获得的土壤改良微生物菌剂。优选的，用于重金属污染土壤下促进对植物生长的应用，或者在养分贫瘠的退化土壤环境中应用。
15.本发明利用园林绿化废弃物具有高c/n比、孔隙度大的特点，以及污泥具有低c/n比、孔隙度低等特点，将两种废弃物各有的优缺点互补，以二者混合堆肥以提高废弃物资源利用率；同时，健康土壤中含有种类繁多，功能多样的微生物，它们协调共生，直接或间接地参与所有土壤生态过程，在维持植物生长和稳定土壤功能方面发挥核心重要的作用，其中核心微生物和优势微生物在土壤功能发挥中的作用尤为重要。而退化土壤中微生物种类和数量急剧降低，因而降低了土壤生态服务功能。通过人为添加功能微生物是一种有效改善和提升土壤质量的方法之一，然而单一微生物菌种的添加往往无法适应复杂的土壤环境，同时单一菌株很难具有全面的植物益生作用和生态功能，因而人工构建含有多菌株、功能互补的菌能更好地发挥促进植物生长，以及土壤改良的效果。本发明基于上述理论和研究结果，将具有解磷、解钾、固氮、产iaa、铁载体、acc脱氨酶、拮抗病原菌的多株功能微生物按不同菌种组合，对比不同菌株混合的综合功能，最终确定用于土壤改良的合成微生物菌。将组合效果最优的微生物菌中各菌等比例混合，添加到园林绿化废弃物与污泥制备的有机调理剂中，有利于微生物菌种活力保持。最终实验表明，人工合成菌添加由污泥与园林绿化废弃物制备的有机调理剂形成的功能微生物菌剂能够最好地发挥土壤改良和提高植物生长的效果。
16.附图说明
17.图1混合堆肥过程中温度的变化。
18.具体实施方式
19.下面通过具体实施例对本发明进行阐述，以期对本发明有更好的理解，但并不构成对本发明的限制。
20.实施例一污泥与园林绿化废弃物不同比例混合堆制效果研究设置污泥和园林绿化废弃物的不同配比共5 组处理，分别为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，记为处理1、处理2、处理3、处理4、处理5。
21.其中，园林绿化废弃物来源于北京平原造林区，主要为各种乔木、灌木修剪枝条和林下枯落物、杂草，废弃物经粉碎机粉碎至长度3cm以下；污泥来源于北京某污水处理厂城市污泥，经高级厌氧消化（高级厌氧消化过程：普通城市污泥输送至高级厌氧消化的料仓，然后被输送至热水解单元中，在165℃条件下水解约30min，经闪蒸破壁后，污泥被输入至中温厌氧消化单元处理进行厌氧消化处理，经约18d-20d 厌氧消化后进入板框脱水单元进行污泥深度脱水）。
22.各处理按两种物料比例要求准备，同时添加堆肥腐熟剂（腐熟剂由北京京圃园生物工程有限公司提供，圃园牌有机废物发酵菌曲，含有芽孢杆菌、放线菌、霉菌、酵母菌等微生物），添加量为堆肥原料重量的0.2%，边混合边添加水，保证物料含水量为50%-55%。将上述材料装入专用堆肥袋进行堆制，堆肥袋容积为0.76 m3，在堆肥过程中为确保堆体中氧气充足，本实验采用翻堆的方式，每6 天翻堆一次。堆肥过程中，每天上午10 点，分别测量堆体的上、中、下三部分的温度，取其平均值，作为堆体的温度指标。堆肥结束时进行样品采
集，将堆体均等分成上、中和下三部分，在上部10-20 cm处、中部40-50cm处、底部70-80 cm处采集等量的堆肥样品，将所采集的3个样品混匀，样品自然风干，用于理化指标的测定。
23.堆体的温度变化是表征堆肥腐熟程度的重要指标之一，而且可以反映堆体腐熟化进程。由图1可知，由于各处理组中污泥与园林废弃物的配比不同，各处理在进入高温期的速度、高温持续时间以及达到的最高温度方面有一定差别。处理3与4分别在堆置96 h和72 h后进入高温期，50 ℃以上分别维持了12 d和11 d。处理5高温期持续时间最长为14 d，最高温度65 ℃。处理2高温持续时间最短为6 d，但是处理1的温度一直低于50 ℃，始终没有达到高温期。本实验结果表明污泥与园林废弃物合理配比有助于物料腐熟进程，更有利于高效、安全地获得腐熟堆肥产品。《畜禽粪便无害化卫生标准》(gb7959-1987)中规定50 ℃以上持续5-7 d即满足堆肥腐熟标准，其中处理2到5高温持续时间均满足标准，处理5的高温持续时间及达到的最高温度相比于其他处理组较好。
24.堆肥结束后腐熟度如何可通过物料的理化性质及对植物种子的发芽势的指标进行综合评价。从ph值来看各处理均在微生物适宜生长的ph范围内，有机碳含量在污泥与园林废弃物比例为1:3时最高，比例为3:1时最低，总氮含量与有机碳的变化趋势相反，这与园林废弃物和污泥两种物料本身的性质有关，各处理的c/n比均低于20，达到有机肥腐熟标准。但从种子发芽势看，污泥与园林废弃物比例1:1（处理3）的值最大，达0.94。研究表明该指标是用以评价堆肥腐熟程度的一个经典生物指标，可以综合反映堆肥产品对植物高毒性（发芽率）和低毒性（植物根长）的影响，一般种子发芽势》0.8，表明堆肥产品已经完全腐熟。综合温度变化、上述理化指标以及种子发芽势，污泥与园林废弃物混合利用，选择比例1:1至1:3均可，具体可根据两类废弃物的实际需要消纳的量进行适当调整。
25.表1 不同比例混合堆肥对理化性质影响处理设置ph有机碳(%)总氮(%)碳氮比发芽指数处理17.4628.813.179.090.71处理27.7228.922.959.560.78处理37.8432.012.6312.170.94处理47.8632.122.3113.900.86处理57.9234.872.1616.140.81实施例二多功能微生物合成菌各菌种的筛选土壤采集于湖南省冷水江锡矿山的联盟、长龙界、七星三个地区共15个土样，该地区素有“世界锑都”之称，锑矿开采具有上百年历史，造成周边土壤重金属污染严重，土壤贫瘠，植物生长受限。土壤中镉（cd）、铜（cu）、铅（pb）、锑（sb）、锌（zn）、砷（as）、hg（汞）和cr（铬）含量范围分别为0.09-0.97 mg/kg，21.03-40.16 mg/kg，3.023-49.79 mg/kg，36.30-263.48 mg/kg，108.61-230.45 mg/kg，62.91-135.52 mg/kg，0.28-0.69 mg/kg，202.64-297.63 mg/kg，其平均含量为0.55 mg/kg，29.65 mg/kg，35.84 mg/kg，104.45 mg/kg，144.13 mg/kg，102.43 mg/kg，0.42 mg/kg，247.68 mg/kg。分别超出湖南省土壤环境背景值6.43，1.04，1.33，35.05，1.53，7.32，4.41，3.70倍，参照《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（gb 15618-2018）中的风险筛查标准8种重金属元素的超标率分别为42.9%、0、0、100.0%、0%、100.0%、0%、57.1%。表明矿山土壤重金属sb、as和hg在所选组采样点中超标率较高，cd和cr次之，zn、cu和pb基本达标。
26.（1）土壤微生物的分离、功能微生物的筛选对采集的土壤进行抗性微生物的分离，首先配制cdm固体培养基（配方：mgso4·
7h2o，2.0g；nh4cl，1.0g；naso4，1.0g；k2hpo4，0.013g；cacl2·
2h2o，0.067g；na-lactate，5.0g；琼脂，15.0g；蒸馏水，1000ml；ph 7.2），并向培养基中添加200mg/l的重金属sb，筛选对该重金属有抗的微生物，分别向cdm培养基中添加100mg/l的as、1mg/l的hg、2mg/l的cd、300mg/l的cr，对分离的抗锑菌进行其他重金属抗性筛选。对于抗重金属综合效果较好的菌株进行菌种保藏，细菌采用lb培养基（配方：胰蛋白胨，10g；酵母浸粉，5g；nacl，10g；蒸馏水，1000ml；配制固体培养基时再添加琼脂，15.0g，真菌采用pd培养基（配方：200 g去皮马铃薯切成小块后，放于蒸馏水中煮，待水开后用8层纱布过滤并用蒸馏水补充至1 l，加入20 g葡萄糖，配制固体培养基（即pda）时再添加琼脂，15.0g）。
27.抗性微生物的功能筛选包括解磷、解钾、固氮、产吲哚乙酸（iaa）、铁载体、acc脱氨酶。因为具有上述功能的微生物能够提高土壤中有效氮、磷、钾的含量，为植物根系提供可吸收、利用的养分。iaa为植物生长素，参与植物细胞的伸长生长、形成层细胞的分裂、维管组织的分化等，此外，iaa能通过对土壤内重金属的吸收和富集，使重金属对植物的毒害减小，从而起到保护植物的作用。铁是地壳中含量丰富，但主要以溶解度极低的氧化物形式存在，不易被植物吸收利用。某些微生物分泌铁载体把fe
3+
还原成植物体能够高效吸收利用的fe
2+
，溶解结合在土壤中的铁元素以供给植物细胞利用；同时一些植物根际微生物通过分泌铁载体增强其与有害病原菌竞争铁元素，从而抑制有害微生物的生长繁殖达到保护植物、促进植物生长的效果。acc脱氨酶可以降低植物体内乙烯的含量，从而缓解逆境胁迫产生的乙烯对植物造成的不利影响，促进帮助植物抵抗逆境，促进植物生长。
28.（2）土壤dna的提取与pcr扩增使用fastdna
®ꢀ
spin kit（mp bio, santa ana, usa）试剂盒，严格按照说明书提取
−
80 ℃保存的土壤的dna，提取后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，dna质量合格的样品进行细菌和真菌特定基因的扩增。细菌扩增16s rdna基因的v3-v4区，真菌扩增its1区。pcr反应体系为：phusion master mix（2
×
） 15 μl；primer（2μm）3 μl；模板dna 10 μl；h2o 2 μl，共30μl。反应程序：98 ℃预变性1 min；30个循环包括（98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃再延伸5 min。
29.（3）高通量illuminamiseq测序及分析使用2%的琼脂糖凝胶电泳纯化pcr产物，切胶回收主带大小在400～450 bp之间的序列，使用thermo scientific 公司genejet胶回收试剂盒进行回收。然后构建文库，经过qubit定量和文库检测合格后，在illumina miseq-pe300测序平台进行上机测序。根据序列长度、质量、引物和标签，使用qiime（version 1.17）对所有数据集进行分析；选择原始序列，删除低质量序列。使用uparse（v7.1）将序列集分类为多个操作分类单元（otus），otu注释基于silva数据库，将所有样品的优质序列按97%相似性进行otu聚类。在物种分类学组成层面，通过各种非监督、监督的排序、聚类和建模手段，结合相应统计学检验方法，进一步衡量不同样本组间的物种丰度组成差异，并尝试寻标志物种。计算各样本的距离矩阵，并通过多种非监督的排序、聚类手段，结合相应统计学检验方法，衡量不同样本组间的beta多样性差异及差异显著性。根据物种在各样本中的组成分布，构建关联网络，计算拓扑指数，并尝试出关键物种。
30.（4）菌株分子鉴定及多功能微生物合成菌各菌种筛选根据筛选获得的纯种微生物物所具有的综合功能，挑选20株进行鉴定，采用分子生物技术对特定基因序列进行扩增、测序。细菌扩增16s rrna基因全长，鉴定结果为同一种的菌株，根据其功能，保留综合功能较优的菌株。根据高通量测序的结果，比较不同取样地的土样中微生物的物种结构组成及多样性，筛选获得自然条件下土壤中优势及核心微生物的物种组成信息。将高通量测序的微生物信息与分离筛选的微生物菌进行综合比较，选择在自然土壤中相对占比较高，同时在分离筛选中占比也较高的微生物类，并将各菌进行两两对峙实验，检测它们之间是否存在拮抗，对于没有拮抗的菌株分别用lb培养基培养细菌，pda培养基培养真菌，测定它们的生长情况，最终根据菌株在自然界的占比丰度、分离筛选菌株的抗重金属和产植物促生因子的功能，及优势物种的生长速度等，做为构建功能菌的依据。
31.实验结果表明，通过微生物对上述重金属抗性和各种功能的测定，共获得抗锑菌株632株，进一步测试抗砷、汞、铬、镉的菌株分别有563株、421株、346株、445株，同时具有上述几种重金属抗性的菌株246株。在此基础上继续筛获得溶解无机磷菌株24株，分解有机磷菌45株，解钾菌70株，固氮菌65株、产iaa菌株103株，产铁载体菌株19株，产acc脱氨酶菌株91株。根据菌株的综合功能，共挑选了20株微生物进行分子鉴定，鉴定结果表明，这些菌分别为假单孢杆（pseudomonas）7株，寡养单胞菌（stenotrophomonas）5株，不动杆菌（acinetobacter）3株，根瘤菌（rhizobium）2株，柔特勒菌属(raoultella)1株，克雷伯氏菌（klebsiella）1株，链霉菌（streptomyces）1株。通过高通量测序分析15个取样地的细菌中相对丰度在前60的优势微生物属中包括假单胞菌，关键微生物中包括寡养单胞杆，这两类微生物也是在微生物分离筛选的微生物中占比最多的两种菌。
32.考虑到退化土壤的各种逆境情况，为了使构建的功能菌发挥稳定的功能，本专利还对实验分离保存的其他来源功能菌进行选择，作为构建本专利合成菌的菌株。包括有从湖南湘潭市某铅锌矿分离获得的青霉菌和曲霉菌，二者具有很强抗铅、锌、铬、锰、铜、砷和镉的能力，且具有高效解磷功能，能够在重金属环境中保持解磷能力，促进植物生长。由于芽孢杆菌类的细菌可产生抗逆性最强的芽孢，且在微生物菌剂中广泛应用，不仅具有对环境超强的适应性，而且往往具有多种拮抗植物病害、促进植物生长的功能，因此在本专利中也考虑使用实验室分离保存的芽孢杆菌类细菌作为构建本专利合成菌的菌株。
33.从中筛选2株假单胞菌、2株寡养单胞菌、2株不动杆菌、1株克雷伯氏菌、2株芽孢杆菌、1株青霉菌和1株曲霉菌，进行两两对峙，它们之间均无拮抗作用。生长速度测试结果表明，其中株1假单胞杆、1株寡养单胞菌、1株不动杆菌、1株克雷伯氏菌、2株芽孢杆菌、1株青霉和1株曲霉均具有较快的生长速度，6株细菌在培养24小时内均达到对数期，2株真菌在培养72小时内也均能产孢，具有较强的应用潜力。上述8株菌可作为功能微生物合成菌备选菌种。
34.实施例三土壤重金属污染胁迫下多功能合成菌对植物生长的促生作用本发明所用的4株细菌：包括假单胞菌（pseudomonas sp.）xks1、不动杆菌（acinetobacter sp.）nxh1、克雷伯氏菌（klebsiella sp.）nxh2、寡养单胞菌（stenotrophomonassp）nxh3，由本实验室从湖南省冷水江市锡矿山锑矿区土壤中分离筛选的菌种，于2016年8月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称
为 cgmcc （单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，：100101），保藏编号分别为cgmcc no.12894、cgmcc no.12895、cgmcc no.12896、cgmcc no.12897。
35.本发明所用的2株芽孢杆菌：耐盐芽孢杆菌（bacillus halotolerans）ls147、暹罗芽孢杆菌（bacillus siamensis）ls275，由本实验室从山西长治地区发生了根腐病的油用牡丹植株的根际土壤与非根际土壤分离筛选出来的菌种，于2020年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，：100101），保藏编号分别为cgmcc no. 19502、cgmcc no. 19505。
36.本发明所用的2株真菌：日本曲霉（aspergillus japonicus）tj1、草酸青霉（penicillium oxalicum）tj2，由本实验室从湖南省湘西州花垣县的铅锌矿表层土壤中分离筛选出来的，于2013年6月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，：100101），保藏编号分别为cgmcc no. 7700、cgmcc no. 7699。
37.将6株细菌分别按2%的接种量接种于500ml lb液体培养基中，30℃、160 rpm摇床中培养48h，涂平板测定各发酵菌液的活菌数，并根据结果将菌液稀释为10
8 cfu/ml，考虑到菌株来源及其功能特征，将4株从湖南省冷水江市锡矿山锑矿区土壤中分离筛选的菌种各取100 ml进行两两等体积组合，共6组，2株从山西长治油用牡丹植株根际分离的芽孢杆菌取100 ml两两等体积组合，共1组，将2株真菌分别接种于pda培养基中，28℃培养72h，用无菌水将孢子洗下，使孢子浓度为108个/ml，各取100 ml两两等体积组合，共1组，以上述菌株单独未组合的作对照，菌株组合处理共8个，单菌处理共8个。所有处理菌液的细菌浓度为108cfu/ml，真菌菌液孢子浓度为108个/ml。将上述菌液施于添加了重金属和污染的土壤中，并种植小油菜，观察植株生长情况。
38.土培实验在北京林业大学苗圃日光温室大棚进行，土壤中添加的重金属种类为在锡矿山土壤中检测到的三种污染最严重的锑、砷、汞，设置两个重金属水平：（1）m1：100.00 mg/kg sb，10 mg/kg cd，5 mg/kg hg；（2）m2：500.00 mg/kg sb，50 mg/kg cd，25 mg/kg hg。盆栽试验所用花盆规格为口径10cm，底边边长7cm，高8cm的方形塑料花盆。每盆装1kg供试土壤，重金属添加后在土壤中稳定30天再开始种植植物和接种微生物。每盆种30粒小油菜，定期定量浇水，保持每天8-10h光照。在种植当天，以及出苗后1周，以喷雾接种的方式向每盆接入浓度为各处理菌液30ml，以喷雾清水的处理为对照。每盆约30粒，实验共34个处理，每个处理3盆，共计102盆。油菜在温室下生长30d后收获。收获时，利用直接测量法测定油菜的株高、根长及植物生物量，以此作为筛选菌种构建合成菌的依据。
39.从统计结果可以看出，与喷雾清水的处理相比，喷雾单菌和两两菌株混合的各个处理均对小油菜的生长有一定促进作用，可缓解重金属对小油菜的毒害，日本曲霉和草酸青霉单一菌株接种的效果相对其他6株细菌明显，xks1+nxh3、ls147+l275两两组合后喷雾处理组比单独菌处理对小油菜株高、根长和植株重量效果更明显，而其他两两组合菌没有明显的增效作用，因此后续在制备合成菌时将选择xks1（假单胞杆）、nxh3（寡养单胞菌）、ls147（耐盐芽孢杆菌）、ls275（暹罗芽孢杆菌）四株细菌，与tj1（日本曲霉）或tj2（草本青霉）中的一株真菌共五株菌来构建。
40.表2 重金属污染胁迫下不同功能菌及菌种组合对植株生长的影响实施例四园林绿化废弃与污泥制备的有机调理剂对微生物菌活力的影响取在lb固体培养基上培养好的假单胞菌、寡养单胞菌、耐盐芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌，分别接种于100ml lb液体培养基中培养24h，各菌液等体积混合后涂布到lb固体培养基平板上，30℃的条件下培养箱中培养24 h，进行活菌计数，结果表明菌剂活菌数达3.54
×
10
9 cfu/ml菌液。
41.取在pda固体培养基上培养好的长满孢子的日本曲霉，用20ml无菌蒸馏水收集曲霉孢子，显微计数结果表明每毫升的孢子量为6.78
×
109个。
42.取上述园林绿化废弃物与污泥比例为1:1的堆肥腐熟产品，自然风干并用小型粉碎机将其粉碎，过10目的筛子，取4000g经高压灭菌（121 ℃、20 min）后冷却（即为有机调理剂），平均分为两份，其中一份作为未加菌的有机调理剂（记为c），另一份在无菌条件下将细菌混合菌液200ml、日本曲霉菌液100ml均匀喷洒其上，经冷冻干燥处理去除水分得到添加有机调理剂的菌剂（记为b）。对同样体积的的细菌混合液和曲霉菌液混合，经冷冻干燥处理得到未添加有机调理剂的菌剂（记为a）。
43.上述a、b和c均放置于室温，并于存放不同时间后进行活菌数统计。为了使两处菌剂处理的结果具有可比性，在进行活菌计数时前，将a与c充分混匀后进行实验。对于菌剂中的细菌用lb固体培养基进行培养计数，真菌用pda培养基进行培养计数。
44.结果表明（表3）：随着存放时间的延长，两种菌剂中的活菌数均有一定的下降，但添加由污泥与园林绿化废弃物制备的有机调理剂的菌剂中，无论是细菌还是真菌的活菌数均比未添加的多，说明有机调理剂的添加有利于微生物菌种活力保持。保存180天后，两个处理活菌数均＞0.2
×
10
8 cfu/g和＞0.2
×
108个孢子/g。
45.表3 有机调理剂添加对活菌数的影响注：细菌单位：cfu/g；真菌单位：个/g。
46.实施例五微生物菌及有机调理剂对土壤改良的协同作用为了明确微生物合成菌与污泥、园林废弃物混合堆肥产品对土壤改良的协同作用，以养分和有机质含量低的沙土为实验土材料，以实施例四中方法制备的未添加有机调理剂的菌剂（a）、添加有机调理剂的菌剂（b），以及未加菌的有机调理剂（c）为研究对象，设为三个处理，分别对应标记为处理a、处理b和处理c。同时以未添加任何材料的沙土为对照。处理b和c分别于每盆装沙土1kg、或c100g，并确保与沙土充分混匀，处理a添加菌剂量要保持与处理b中含有的菌剂量一致以确保实现结果的可比性。每盆种高羊茅种子100粒，每个处理10盆，以相同条件进行日常管理，30天后测定植株高度，刈割后收集地上部，80℃烘箱烘干至恒重后测地上部干重，60天后收集土壤测定其养分、有机质及微生物等指标。结果表明如表4所示。
47.表4 微生物有机调理剂对高羊茅生长和土壤改良效果通过结果可知，与对照相比，添加菌剂（处理a）、添加有机调理剂的菌剂（处理b），以及添加未加菌的有机调理剂（处理c）均可以有效改善土壤质量，降低土壤容重、提高土壤毛管孔隙度，增加土壤有机质、碱解氮、速效磷，速效钾含，增加土壤微生物量，增加高羊茅植株高度和地上生物量，其中以处理b，即微生物菌与有机调理剂同时添加的综合效果最佳，且与只添加菌剂的处理a和只添加有机调理剂的处理c之间存在显著差异，说明二者协同作用对土壤改良和植物生长的促进效果最佳。

技术特征：

1.一种土壤改良微生物菌剂的制备方法，其包括如下步骤：将污泥与园林废弃物按1:1至1:3比例混合，在其中添加多种微生物构建合成菌，所述菌包括具有解磷、解钾、固氮、产iaa、铁载体、acc脱氨酶、拮抗病原菌功能的多种菌。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌包括假单胞菌（pseudomonas sp.）、寡养单胞菌（stenotrophomonassp）、耐盐芽孢杆菌（bacillus halotolerans）、暹罗芽孢杆菌（bacillus siamensis），与日本曲霉（aspergillus japonicus）或草酸青霉（penicillium oxalicum）组合构建合成菌；优选地，假单胞菌、寡养单胞菌的保藏编号分别为cgmcc no.12894、cgmcc no.12897；耐盐芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌的保藏编号分别为cgmcc no. 19502、cgmcc no. 19505；日本曲霉、草酸青霉的保藏编号分别为cgmcc no. 7700、cgmcc no. 7699。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述园林绿化废弃物是乔木、灌木修剪枝条和林下枯落物或杂草，经粉碎机粉碎至长度3cm以下；所述污泥是污水处理厂城市污泥，经高级厌氧消化，更多的是，所述高级厌氧消化过程：普通城市污泥输送至高级厌氧消化的料仓，然后被输送至热水解单元中，在165℃条件下水解约30min，经闪蒸破壁后，污泥被输入至中温厌氧消化单元处理进行厌氧消化处理，经约18d-20d 厌氧消化后进入板框脱水单元进行污泥深度脱水。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，取所述园林绿化废弃物与污泥按比例混合堆肥腐熟后，自然风干并用粉碎机将其粉碎，过10目的筛子，经高压灭菌后冷却得到堆肥腐熟产品，加入所述菌得到土壤改良微生物菌剂。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述堆肥腐熟的方法是，按比例取园林绿化废弃物与污泥，添加堆肥腐熟剂（优选地添加量为堆肥原料重量的0.1%-0.3%），保证物料含水量为50%-55%，用堆肥袋进行堆制，在堆肥过程中确保堆体中氧气充足。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在堆肥过程中为确保堆体中氧气充足是采用翻堆的方式，优选每5-6天翻堆一次。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，取培养好的假单胞菌、寡养单胞菌、耐盐芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌进行混合培养得细菌混合菌剂，将所述混合菌剂和所述日本曲霉菌液分别喷洒在所述堆肥腐熟产品表面，即得土壤改良微生物菌剂。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细菌混合菌剂中的活菌数为3
×
10
9 cfu/ml—4
×
10
9 cfu/ml菌液，所述日本曲霉菌液每毫升的孢子量为6
×
109个—8
×
109个。9.如权利要求1至8任一项所述的方法获得的土壤改良微生物菌剂。10.如权利要求9所述的土壤改良微生物菌剂作为土壤肥料添加剂的应用，优选的，用于重金属污染土壤下促进对植物生长的应用，或者在养分贫瘠的退化土壤环境中应用。

技术总结

本发明涉及肥料技术领域，具体涉及土壤改良微生物菌剂及制备方法和应用。本发明将含有不同功能的多种微生物构建合成菌，与园林绿化废弃物和城市污泥配制的有机调理剂组合，在实现废弃物资源高效利用的同时，将有机调理剂与微生物菌混合制备微生物菌剂，发挥微生物菌剂的土壤改良和修复功能，用于土壤改良。既解决园林绿化废弃物城市污泥合理的资源化利用，又稳定微生物菌种活性和功能，并实现退化土壤的改良效果。土壤的改良效果。