第3章麂属动物的遗传变异和进化
麂属动物（Muntiacus）的细胞遗传学一直是国内外研究的热门课题，赤麂2n＝6 ♀，7♂，是哺乳动物中已知染体数目最少的种类。麂属的不同种间染体数目差异很大，其变异幅度远远超过哺乳动物中其他的属。不同的种具有不同的核型特征，其演化过程很有规律。在80年代后期，通过核型多态的研究又发现了一个新种——贡山麂（M．gongshanensis）（施立明，马彩霞 1988）；去年以来，又有证据表明在越南、老挝边境地区又发现了两个新种，这在大型哺乳动物中是绝无仅有的。 3．1 贡山麂的新核型
我们在开展中国麂属动物染体进化与分子进化研究中，发现1只来自云南贡山县的雄性麂，无论其外部形态、头骨结构或核型特征，都与已知的5种麂有明显的不同。为此，我们又在该地区捕获了1只雄性麂，进行了染体制片和细胞遗传学观察，认为是一个新种。这一看法得到了后来形态学研究的证实（马世来等 1990）。说明了遗传学研究在动物分类学中可以起到积极的作用。
该雄性成年麂捕自云南省西部高黎贡山北段东坡，体重24kg，体长1 045mm，体背毛暗褐，前额棕黄，无明显簇状冠毛，体侧和四肢呈暗灰黑，腹部暗沙灰。我们以骨髓体外短期培养的方法制备细胞染体标本，经100个以上中期骨髓细胞的观察计数，确定贡山麂的染体数目为2n＝9♂。在根据染体形态大小排列的常规核型中，Nos．1的一条同源染体为亚中着丝粒，另一条为端着丝粒染体， 呈异形性。Nos．2，3为亚中着丝粒染体。Nos．4为较小的端着丝粒染体。此外，核型中还有一小的亚中着丝粒染体。
已知哺乳动物性染体富于嗜银性并有特殊的形态和配对特征，在联会复合体分析时易于和常染体区分鉴别（施立明1986）。贡山麂精母细胞联会复合体分析表明，Nos．1的S．C 一端染较深，即富嗜银性，也比较膨大，可以判断为X染体和Y染体配对形成短小的S．C。在粗线期的不同阶段，配对的程度可以不同。在早粗线期，XY靠拢，端部接近，在中粗线期，XY密切配对，在晚粗线期又开始分离。这就证明，在Giemsa染的体细胞核型中，亚中着丝粒的小染体的确是Y。Nos．1的S．C长臂实际上是常染体。看来，这条常染体是端着丝粒形态，由于在进化过程中和X易位，就形成亚中着丝粒的复合染体（XA）。
在C带核型中，可以看到每对染体的着丝粒区都分布有大小不等的C带，即结构异染质。值得注意的是，在X和常染体易位形成的复合染体的“颈部”特别富于结构异染质，这种特征的C带分布和预期的相吻合。
银染结果表明，银染核仁组织者（Ag-NORs）即18s＋28s核糖体基因分别出现于Nos．_______________________进化标记
本章作者：王文，兰宏，杨凤堂，马彩霞，张亚平
20 中国动植物的遗传多样性
1，4染体的长臂。电镜观察表明，Nos．1，4和S．C长臂附有清晰的核仁，和体细胞的银
染结果相一致。
上述体细胞核型和减数分裂S．C分析表明，贡山麂的核型有其独特的特点。已知小麂（M．reevesi）的2n＝46（Wurster and Bernischke 1967），赤麂（M．mvaginalis）的2n＝6♀，7♂（施立明 1976；Wurster，Bernirschke 1970），罗氏麂（M．rooseveltorum）的2n
＝7♂（Wurster 1985）无论是染体的数目还是染体形态都和贡山麂的明显不同。
分布于我国浙西、皖南地区的黑麂（M．crinifrons）的2n＝8♀，9♂。虽然两者的雄性 染体数目相同，但黑麂的一条Nos．1染体为亚中着丝粒形态，已知也是X和常染体易
位形成的复合染体，但另一条同源染体却是典型的中着丝粒形态。Nos．2染体一条为
亚中着丝粒形态，另一条同源染体却是端着丝粒形态，这种复杂的染体异形性涉及染
体易位和倒位（施立明 1983，1987）。因此，黑麂的Nos．1，2染体和贡山麂的也有明显
的区别。推测雌性贡山麂的2n＝8，其染体数目和形态可能和黑麂的相同或十分相似。但银
染的结果表明，虽然贡山麂和黑麂的Nos．4染体长臂都带有Ag-NOR，但黑麂的另一对NOR分布于Nos．2染体上，而贡山麂的另一对NOR分布于Nos．1染体上，就是说这
两种麂的核糖体基因的分布位置不同。
分布于马来西亚的赤麂属于指名亚种M．m．muntjak。据Wurster和Atkin（1972）报道，
其2n＝8♀，推测雄性的2n＝9♂，染体数目和贡山麂相同，但通过核型的比较分析表明，虽
然这两种麂的X都易位到一条常染体上从而形成亚中着丝粒的复合染体（XA），但这两种
麂的这条染体长度似有不同。根据地理分布区域的不同，贡山麂也不太可能是赤麂的指名亚
种M．m．muntjak。此外，据昆明动物研究所兽类分类工作者的初步检测，贡山麂的外部形态
与头骨特征和赤麂（M．muntjak）的差异较大。Soma（1983）曾报道，泰国曼谷动物园一只雌
性费氏麂（M．feae）的2n＝13，因这只费氏麂是一个罗伯逊易位的携带者，故推测正常雌性
动物的2n＝14，雄性费氏麂的2n＝15（Soma 1987）。此外，除Nos．1为亚中着丝粒染体外，核型中其他染体都是端着丝粒形态。我们的结果清晰地表明，贡山麂的核型无论是染
体数目，或是染体形态都明显不同于原产缅甸南部和泰国南部的费氏麂。
综上所述，贡山麂的核型特征和现知的5种麂都有不同。核型是细胞分类学的一个重要
依据，特别是对于麂属（Muntiacus）更是如此（施立明 1980）。因此，进一步收集更多的个体，并以多种染体分带技术综合比较解剖学和分类学特征，深入研究分布于我国滇西北，
包括藏南的贡山麂的细胞遗传学，确定其正确的分类地位——是新的亚种或是独立的新种，
具有重要的意义。
3．2 麂属动物核型的染体涂染比较
麂属由于其核型多样性和一些种在进化中染体重组率高而一直受到关注。在迄今发现
的哺乳类中，印度麂有最低数目的二倍体染体数目（2n＝6、7）（Wurster，Benirschke 1970）；进一步研究此属的染体数表明：黑麂（M．Crinifrons）2n＝8、9（施立明 1983），贡山麂（M．g ong shanensis）（施立明，马彩霞 1988）、雌性费氏种2n＝13（M．feae 1983）和雄性费氏种2n＝14（施立明未发表），中国麂（M．reevesi）2n＝46（Wurster，Benirschke 1967）。研究结果还表明印度麂和中国麂在核型上有20条不同染体，但在表型
第3章麂属动物的遗传变异和进化21
上相似，两个种进行人工交配能产生幼仔，但后代是不育的（Shi，Pathak 1981），对这两个种的G-带比较研究表明，G-带有很高的同源性（施立明等 1980）。此结果也支持Hsu（1975）等的看法，即印度麂染体可能是多条染体串联着丝粒融合的结果。而且，通过对麂属mtDNA限制性片段长度多态分析表明，现代麂属所有种大约在200万年前发生分化，贡山麂和黑麂则不同，大约在60万年前分化（兰宏，施立明 1994）。因此，麂属是研究核型进化和物种形成的一个很好的模型。
一些学者提出很多假说来证明串联融合理论，有两个证据支持此理论，即：①在细胞间期，中国麂的点状着丝粒非随机地聚集成束形成小的聚集体，表型上和在印度麂间期细胞核中观察到的复合着丝粒单元很相似（Brinkley等 1984）；②中国麂的着丝粒区的异染质C5序列和哺乳类端粒DNA序列在印度麂染体上都有定位，而且，和其他麂属的G-带带型比较分析也支持此理论，即它们的核型有差异是由于祖先染体的串联和着丝粒融合，但组合方式又有所不同（Fontana，Rubini 1990；施立明未发表）。Elder和Hsu（1988）认为在中国麂基因组的进化过程中，其单倍数的染体大约发生了17
次染体串联、3次着丝粒融合事件。Lin等学者支持这一观点（1991），他在二倍染体中检测到了30多个卫星DNA序列间质位点。
染体涂染法是用有分类特征的染体制成探针混合物，检测人类（Cremer等 1988；Lichter等 1988；Pinkel等 1988）、灵长类（Wienberg等 1990，1992；Jauch等 1992）和远缘哺乳类（Scherthan等 1994）在染体进化中的细胞遗传学特征及复杂性和隐蔽的染体重排现象。令人庆幸的是，麂属染体数目少而且比较大，用荧光活化细胞分类器就能把印度麂所有的染体分开（Carrano等 1976；Levy等 1991）。近来，随着染体分类技术和多聚酶链式反应（PCR）技术的结合，特别是和退化低聚寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）的结合，能够用少数染体快速地建立染体特异文库和涂染点（Telenius等 1992）。此技术也促进了反向染体涂染法的发展，即将少数突变染体片段经DOP-PCR产生涂染点探针，与正常中期分裂相杂交，以显示突变染体的突变位点（Carter等 1992）。
1995年我们实验室与剑桥大学合作进行了染体涂刷（chromosome painting）研究，以探讨麂属动物的染体的进化方式（Yang等 1995）。实验所用的雌性印度麂（KCB89003L）、雌性贡山麂（KCB92001）、雄性和雌性黑麂（KCB82001，KCB81002E）以及雄性中国麂（KCB92036）细胞株由中国科学院昆明动物所细胞库提供。实验方法和结果如下。3．2．1 增强DAPI带的核型和染体组型模式图
进行染体涂刷，通常只能获得弱的DAPI带。通过5×5高透滤光镜的增强作用，可提高DAPI带的强度。图3-1显示增强后雌印度麂、雌贡山麂、雌雄黑麂和雄中国麂的DAPI核型。为了便于进行细胞遗传学分析，我们构建了印度麂、贡山麂、黑麂和中国麂的染体组型模式图。对于印度麂而言，增强的DAPI带核型是相同的，但并不同于Levy等（1993）所描述的G带染体组型模式图。特别是，我们发现1p3上有4条带，1q1上有7条带，而Levy 等则认为1p3上有6条带，1q1上有9条带。增强后雌黑麂和贡山麂的DAPI带核型是相似的。雌贡山麂的常染体区域很大程度上相当于雌黑麂的如下区域：（X＋1）q≈1q，2≈2，3≈3，4q≈（X＋4）q，4p≈1p，X≈X，与贡山麂的1q，2p，（X＋4）q，1p区各自相比时，发现（X＋1）q区域缺少4条带，2p区多出4条带，4q区缺少2条带，而4p区又多出2条带。在2q，3，和X染体臂这些区域中，贡山麂和黑麂的带型是类似的。在黑麂染体1q和2p
22 中国动植物的遗传多样性
区域也能观察到异型变异形态的染体。这种变异在细胞系建立初就已存在，并且在其后的传代过程中一直保持着。雄黑麂显示出一种复杂的核型，这与Shi（1983）的报道一致。与雌黑麂相比较，发现在染体1的一个拷贝、染体X＋4的一个拷贝以及正常染体2和3配对中，有一个中着丝粒染体、一个小亚中着丝粒染体和一个端着丝粒染体。DAPⅠ带显示未配对的端着丝粒染体与染体1上的q臂是同源的，且我们定义它为1q。小亚中着丝粒染体即是Y染体。中着丝粒染体q臂末端似相当于（X＋4）q区域。此观察结果结合联会复合体分析（马昆，施立明1988）及染体绘图实验
的结果，我们将此区域命名为1p＋4。在雄黑麂中未观察到在雌黑麂核型中所见到的异形结构。
3．2．2 与印度麂染体涂染比较的基因组分析
体现着雌印度麂整个基因组的染体1，2和X＋3图可由单独（单FⅠSH）或共同（三FⅠSH）杂交获得，这种杂交可在贡山麂、黑麂和中国麂的中期核细胞中进行。由于每一染体着部分都包含了同源的着丝粒异染质部分，故所有的着丝粒异染质均被染成黄。通过原位杂交图和增强DAPⅠ带相结合的图像处理系统，可得到特定的杂交信号。为减少对三杂交信号判断的误差，利用单杂交信号与之对比。
贡山麂和黑麂都有相同的二倍体染体数目，雌性为2n＝8，雄性为2n＝9。与印度麂染体杂交显示出两种麂的染体所有区域均被染成黄。贡山麂的（X＋1）q染体区域的杂交情况很大程度上与黑麂的1q区域相对应，然而仔细地比较后发现，贡山麂（X＋1）q染成红的区域比相应的黑麂1q上区域小，并且在贡山麂（X＋1）q中缺少了在黑麂1q中紧接着丝粒下面的一小部分染为黄的区域。两种麂的2p区与印度麂的染体2杂交均为绿。贡山麂的2p区中染成红的部分比黑麂中相应部分多，并且在贡山麂2p的着丝粒上面有一小的染为黄区域，而在黑麂中无此区域。2种麂的染体3的染情况相似。除了黑麂（X＋4）q上紧接着丝粒下端有一额外的天然红区域外，贡山麂4q和黑麂（X＋4）q区的杂交着情况相似。贡山麂4p区和黑麂1p的杂交情况相似，但不完全相同。贡山麂4p上着红的区域比黑麂1p上着红的区域大。
染体1，2，3和X＋4的染情况与雌麂的相似。端着丝粒1q的染图与亚中着丝粒染体的长臂一样。染体1p＋4的短臂从pter到着丝粒依次被染成“红－绿－黄”，而其整个长臂均被染上红。1p＋4短臂上黄区域，例如（1p＋4）p11-14的带型显示了1p11-14相似的带型。中国麂有46条染体。将所有染体的着丝粒被染成不同大小区域的黄，通过比较同一中期细胞核的增强DAPI带和三、单（数据未在此显示）杂交图，构建出三的核型图。染体1q2-qter，3，4，5q1，7，12，19，20，22染成红，染体1q1，2，10，11，13，14和15染为绿，染体5q2-qter，6，8，9，16，18，21和X染体染成黄。由于雌印度麂不含Y染体，小Y染体只显示出弱的信号，所以大多数情况下为着丝粒上的一强的黄点。
3．2．3 结论
我们首次使用了染体特异性的染方法对印度麂与其他种的麂进行杂交研究，采用精确的染体带和相关杂交信号分析的三FISH杂交比较了麂属的整个基因组结构。
除染体1，5和Y外，中国麂的所有染体与标记的印度麂杂交后均着为三种颜中的一种。这为现生印度麂核型是由类似于中国麂的祖先通过串联重复和着丝粒融合进化而来
第3章麂属动物的遗传变异和进化23
（shi等 1980）的假说提供了依据。染体1和5的三着可用染体重排来解释，例如发生于串联重复部位和着丝粒融合处的相互易位。另外，现生麂的祖先具有的染体数目可能比46条多，也许像Neitzel（1997）和Fontana及Rubinin（1990）所推测的2n＝70（NF＝70）。这种阐述假定了中国麂是从其祖先的核型通过12个连续重复串联融合构成4大端着丝粒对衍化而来（Fontana，Rubini 1990）。用其他种类的麂与中国麂染体杂交作图的实验将对解释这个问题有帮助。
印度麂、黑麂和贡山麂代表着麂属动物中二倍体染体数目低的三个种，其中贡山麂是近期才发现的新种（马世来等 1990）。通过比较增强DAPⅠ带和染体着类型，可见黑麂和贡山麂的核型是相似的，因此推测两者之间有近的亲缘关系。在三种麂中存在大量未改变的同线期染体。X染体臂是最明显的保守区。同样，分别地比较印度麂与黑麂、印度麂与贡山麂染体带图的结果是，印度麂的1q17-qter相当于黑麂和贡山麂的3q13-qter，印度麂的1p22-pter相当于贡山麂的4q23-qter或是黑麂的（X＋4）q23-qter，印度麂的2q11-q34相当于黑麂和贡山麂的2q15-qter。麂属种间染体的同源性说明印度麂、黑麂和贡山麂各自独特的核型是通过一系列的不同组合形式的串联和着丝粒融合而由一个共同的祖先演变而来。由于现生麂在200万年以前就已发生了分化（兰宏，施立明 1991），那么大的同线染体的存在也说明串联融合在麂染体进化过程中是非随机的。
染体显带和联会复合体分析为麂属动物比较细胞遗传学的研究提供了重要依据（Shi 等 1980；Neitzel 1987；马昆，施立明 1988；施立明，马彩霞 1988；Fontana Rubini 1990）。然而染体
显带和联会复合体分析技术不能阐明染体上较为精细的重排现象。例如，用这两种技术仅仅用显带的同源性不能观察到贡山麂和黑麂之间的差异。而染体染的增强DAPⅠ带却能使我们通过显带的同源性和DNA含量的同源性分析观察到种的差异。
雄黑麂复杂的核型使我们很难理解此物种的性别决定机制。为阐明此问题，马昆和施立明（1988）采用表面铺展技术观察了精母细胞粗线期的联会复合体，发现了涉及到染体1，1q，X＋4，1p＋4和Y的多价体现象。分析多价体构象，推测出亚中着丝粒1P＋4的进化涉及两个步骤，第一步是端着丝粒发生了臂内倒位成为亚中着丝粒，第二步是与1p串联融合成中着丝粒染体，按此解释的话，现在的中着丝粒1p＋4末端短臂应与1p同源。但是，染体染并不支持这种说法，因为1p的杂交图不同于1p＋4染体末端杂交图。染体1p＋4和1p以及1p＋4和X＋4之间显带和染的部分相似性说明至少部分1p和（X＋4）q源于1p＋4。我们的结果支持在（X＋4）q24和（X＋4）q12之间断裂后发生了同臂内倒位，并将1p11-14插入到（X＋4）q12区，而由此失活或丢失了（X＋4）q着丝粒，从而激活了潜在于1p的着丝粒这种说法。对黑麂进一步比较染体绘图的工作还有待深入，这对精确地阐明在此核型中发现的染体重排现象有很大帮助。
我们采用增强DAPI显带技术比用传统胰蛋白酶-G显带技术能获得更高质量的带型。与常规只能给出模糊带型的直接DAPI显带技术相比，增强的DAPI显带可获得高反差、清晰带，且易于对原位杂交信号与特异带之间的关系进行精确分析以及在DNA水平上类比带与带间的同源性。
我们的研究结果提供了一套完整的染体分类、DOP-PCR、多颜染体染以及计算机化图形分析的技术，适用于对相关种类动物核型进化研究中复杂的或小染体重排的分析。进一步的研究包括对除印度麂外其他麂属动物的染体绘图，以及提供有关在进化过程中染体融合和转位的进一步证据。
24 中国动植物的遗传多样性3．3 线粒体DNA多态性和麂属的遗传分化
我们用3只来自云南省怒江州的贡山麂、2只来自云南省西双版纳的印度麂、1只来自浙江省开化县的黑麂、2只来自昆明市郊西山区的中国麂作为材料，提取和分析mtDNA。mtDNA 纯化后用12种限制性内切酶（EcoRⅠ，BamHⅠ，Hind Ⅲ，BglⅠ，BglⅡ，EcoRⅤ，KpnⅠ，SacⅠ，PstⅠ，ClaⅠ，AvaⅠ和ApaⅠ）进行酶解。限制性内切酶图谱用单酶解结合双酶解方法构建。基于线粒体DNA限制性酶谱，以mtDNA全序列已被发表的黄牛（Anderson等 1982）作为外（outgroup），将可变位点编成“0”、“1”特征矩阵，利用PAUP2．4版（Swofford 1985）中的branch and bound法和PHYLIP3.5版中（Felsenstein 1993）的Dollo程序构建简约进化树（parsimonic tree）。此外，根据位点共享度，我们还计算了物种间的遗传距离（Nei Li 1979），基于遗传距离利用PHYLIP3．5版中的FICH和KITSCH构建了距离进化树。
表3-1为限制性位点0，1特征矩阵。基于特征矩阵用PAUP中的branch和bound算法得到6棵最简约树。这6棵树揭示的种间分枝关系相同，只是种内关系有所差异。从这6棵树得到的合意树（consensus tree）与Dollo法得到的树完全一致。该树（图3-1a）表明，黑麂和贡山麂关系最为接近，其次它们与中国麂接近，印度麂则是相对独立的一枝。
种内的遗传距离小于1％，黑麂和贡山麂的距离为2％，其他种间的距离值在4％～7％之间（表3-2）。
基于遗传距离矩阵，FITCH和KITSCH也得到了拓扑结构一致的系统树（图3-1b）。该距离树与简约树（图3-1a）揭示的种间进化关系相同。
虽然麂属动物种内的遗传分化不高，但印度麂不同个体间的位点变异还是包含了一些亚种划分的信息。传统上海南的印度麂属于M．m．nigripes，云南及附近区域的则被认为是M．m．vaginalis（Osgood 1932；Allen 1940）。但是，1988年Ma等认为，云南及邻近区域分布有两个印度麂亚种，即云南南部的M．m．menglalis和云南北部的M．m．yunnanensis。mtDNA数据支持这一观点。来自滇南的IM1与来自滇北的IM2间的遗传距离和它们与海南亚种（IM3）间的距离相当（表3-2）。因此，IM1可能属于M．m．menglalis，IM2则属于M．m．yunnanensis。
简约法和距离法得到的系统树都提示贡山麂和黑麂非常接近，它们线粒体DNA之间的
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