◆ TRIpure Reagent 抽提指南 |
◆ 目录号 RP02 |
◆ 使用手册 |
◆ 实验室使用，仅用于体外 |
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细菌基因组DNA提取试剂盒
目录号：DN12
目录编号 | 包装单位 |
DN1201 | 50次 |
DN1202 | 100次 |
DN1203 | 200次 |
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适用范围：
适用于快速提取各种细菌基因组DNA
试剂盒组成、储存、稳定性：
试剂盒组成 | 保存 | 50次 | 100次 | 200次 |
| 室温 | 30 ml | 60 ml | 120 ml |
| 室温 | 10 ml | 20 ml | 40 ml |
DNA溶解液 | 室温 | 10 ml | 15ml | 30 ml |
RNase A(10mg/ml) | -20℃ | 150μl | 250μl | 400μl |
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本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:
1.环境温度低时细胞核裂解液中某些去污剂成份会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，轻轻旋摇，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
2.蛋白沉淀液可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，如果不能完全溶解，也不影响使用效果，直接取用上层溶液即可。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：
本试剂盒用于快速的从各种细菌中提取基因组DNA。细菌样品加入细胞核裂解液(或者通过溶菌酶或者其它一些酶帮助裂解细胞壁后)，首先在强去污剂作用下裂解细胞释放出基因组DNA，接着加入RNase A去除RNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。
产品特点：
1.不需要使用有毒的苯酚等试剂。
2.快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。
3.结果稳定，产量高，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达50 kb -150kb，可直接用于构建文库，PCR，Southern-blot和各种酶切反应。
注意事项
1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.用户需自备异丙醇、70％乙醇、0.5M EDTA和Lysozyme（溶菌酶）(用于革兰氏阳性菌)、lysostaphin(用于某些难裂解的革兰氏阳性菌)、水浴箱。
3.开始实验前将需要的水浴先预热好备用。
4.本试剂盒为溶液型，可以很容易的按照比例扩大或者缩小每次处理的细菌细胞量，请索取其它处理量的操作手册。
操作步骤：涡旋振荡器（实验前请先阅读注意事项）
1.收集1毫升过夜培养细菌加入1.5毫升离心管。
2.9,000rpm离心30秒，使细胞沉淀下来，弃上清，涡旋或轻弹打散细胞沉淀。对革兰氏阳性菌，接步骤3。对革兰氏阴性菌，直接接步骤6。
3.加入480μl 50mM EDTA完全重悬细胞。
4.加入120μl溶菌酶 (20mg/ml in 10 mM Tris-HCl，pH 8.0)，混匀。
对于大部分的革兰氏阳性菌如Bacillus subtilis，Micrococcus luteus，Arthrobacter luteus，Nocardia otitidiscaviarum，Rhodococcus rhodochrous和Brevibacterium albidium，使用溶菌酶就可以有效裂解。但是对于某些种类的Staphylococcus，则应该加入60μl溶菌酶(20mg/ml)和60μl lysostaphin (20mg/ml)确保有效裂解。
5.37℃温育30-60分钟。12,000rpm离心2分钟，弃上清，涡旋或轻弹打散细胞沉淀。
6.加入600μl细胞核裂解液至打散的细胞，轻柔吹打裂解细胞。
7.80℃温育5分钟裂解细胞，然后冷却至室温。
8.加入1.8μl RNase A（10mg/ml）至裂解物中至终浓度30μg/ml。颠倒混匀后37℃温育15-60分钟去除残留RNA。然后室温冷却至少5分钟使回复到室温。
9.在回复到室温的裂解物内加入200μl蛋白沉淀液后，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀25秒。混匀后可能见到一些小的蛋白团块。冰浴5分钟。
由于样品体积重量小，用涡旋振荡器振荡混匀产生的剪切力并不会剪切打断基因组DNA。如果用手振荡混匀，则不可以用手上下剧烈振荡混匀，只能适当力度振荡混匀，否则会剪断基因组DNA；但是力度也不能小，要保证充分混匀，将粘稠的裂解物打散开，否则DNA无法和蛋白质沉淀分离开，离心的时候会和蛋白质一起沉淀下来，造成DNA丢失或者降低产量。此外混匀不充分也可能造成蛋白沉淀不充分， 最后的产物污染有较大量的蛋白质。因此建议用涡旋振荡器。
10.13,000rpm离心5分钟。这时候应该可以见到管底白的蛋白沉淀，也可能见到一些蛋白沉淀漂浮在液体表面。
11.小心吸取上清到一个新的1.5ml离心管中。
吸取上清时小心不要吸到管底的和漂浮在液体表面的蛋白沉淀，如果不小心将蛋白沉淀转入新的离心管中，可再次离心2分钟后取上清。
12.加入等体积的室温异丙醇（约600μl），轻柔颠倒30次混匀或者直到出现棉絮状（丝状）白DNA沉淀。
注意有时候棉絮状（丝状）DNA颠倒混匀的时候，粘附着在盖子或者管口处，即使颠倒也不跟下来，这样导致操作者看不到沉淀，误认为没有得到DNA。解决办法是略去步骤13，直接12,000rpm离心1分钟，弃上清，然后接步骤15。
13.垂直放置离心管，让白DNA沉淀自然沉到管底，然后尽可能多的吸弃大部分的上清，注意不要吸到沉淀。
14.加入1ml 70％乙醇后，颠倒漂洗DNA沉淀，12,000rpm离心1分钟，在管底可以见到白的DNA沉淀块，倒弃上清。
15.加入0.5ml70％乙醇，颠倒几次漂洗DNA沉淀，12,000rpm离心1分钟， 倒去上清（注意不要把DNA沉淀倒掉了），倒置后在吸水纸上轻敲几下以控干残留乙醇，还可以用头小心吸掉管底沉淀周围和管壁的残留乙醇，空气晾干沉淀几分钟。
注意不要干燥过头，否则DNA极其难溶；也不能残留太多乙醇，否则乙醇可能抑制下游如酶切反应。
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