脱氧核糖法检测羟基自由基清除能力与溶剂影响
【总流程图】
脱氧核糖法评价（•OH）清除能力的总流程图
图1 改进的脱氧核糖降解试验的操作过程[1]
说明：脱氧核糖降解试验广泛用于评估羟基(•OH）食物或药物的自由基清除能力。我们比较了在乙醇溶液中制备的25个抗氧化剂样品与去除乙醇（残留物）后制备的样品的羟自由基清除活性。数据表明，乙醇溶液和残渣样品的测定结果相差约9倍。这表明酒精的强烈干扰。 为了进一步研究其机理，用脱氧核糖法测定了18种有机溶剂（包括乙醇）的清除活性。大多数纯有机溶剂（尤其是醇类）都能有效清除羟基自由基。
【实例】
三种典型的抗氧化剂（含阿魏酸、槲皮素和褪黑素）的浓度响应曲线，在乙醇溶液和挥干乙醇后的对比。这表明乙醇有严重干扰。
图2 阿魏酸的浓度响应曲线（挥干乙醇和乙醇溶液的对比）
图3 槲皮素的浓度响应曲线（挥干乙醇和乙醇溶液的对比）
图4 褪黑素（Melatonin）的浓度响应曲线（挥干乙醇和乙醇溶液的对比）
【背景介绍及溶剂影响的原因分析】
脱氧核糖降解试验自1987年建立以来，已广泛用于评估食品、营养素和药物的羟自由基清除能力。在脱氧核糖降解试验中，通过芬顿反应获得•OH，随后，•OH攻击脱氧核糖并打破其环呋喃环，生成丙二醛（MDA）。MDA与2-硫代酸（TBA）结合，在530 nm处产生λmax的有物质。
因此，A530nm值与生成的羟基自由基的量成正比，A530nm值越高，表明OH自由基水平
越高。如果添加抗氧化剂样品，A530nm值将降低，表明抗氧化剂清除了一些OH自由基。这是脱氧核糖降解测定的原理。
与大多数生化分析一样，脱氧核糖分析需要在测量之前使用各种有机溶剂制备样品溶液。然而，据观察，通常用于制备这些样品溶液的有机溶剂（尤其是醇类）可能会产生强烈干扰，而这些干扰往往被分析用户忽视。几个研究小组明确表示，他们使用有机溶剂制备样品溶液，样品溶液直接用于脱氧核糖测定。例如，至少有七组报告称，他们使用酒精溶解样品，这是通过分析直接测量的。一个研究小组甚至直接将食用葡萄酒用于检测，以评估葡萄酒中酚类化合物的羟基清除能力。
由于抗氧化剂样品的水溶性通常不足以在室温下制备样品储备溶液，我们认为有更多的研究小组使用有机溶剂溶解样品，因此可能会出现问题。甚至更广泛。因此，所有这些调查都被认为是不可靠的。因此，在本研究中，我们系统地研究了各种溶剂的作用，以提高脱氧核糖分析性能。
【实验数据支持】
在本研究中，我们首先比较了25种抗氧化物(结构式见图5)在乙醇溶液中和在缓冲液中（去除乙醇后）的残留物的羟自由基清除活性。
为了探索酒精干扰的机制，使用原始的化学试剂测定了纯乙醇的羟自由基清除能力脱氧核糖测定。结果表明，乙醇本身呈现剂量-反应曲线，在800微升的反应体积中，其IC50仅为1.86±0.13微升。这意味着少于3微升的乙醇足以清除大多数羟基自由基（>90%）。这些结果与之前的报告一致，即乙醇可以作为自由基清除剂，并可以保护DNA免受清除羟基自由基的影响。总之，酒精对测定的干扰源于乙醇本身的羟自由基清除能力。
。
图5, 25种抗氧化剂的结构
为了系统地研究溶剂效应，使用原始脱氧核糖测定法测定了另外17种纯有机溶剂的干扰。数据表明，所有溶剂都能有效清除羟基自由基。我们根据IC50羟基自由基值将有机溶剂分为四种主要类型。
（1）正己烷和石油醚是最弱的清除剂正己烷和石油醚（低级烷烃的混合物）是仅包含σ键（C–H和C–C σ键）的碳氢化合物，其具有稳定性，而且耐羟基自由基的损伤。此外，这些溶剂的水溶性差也阻碍了与水反应系统中的羟基反应。
（2）如 所示，环己烷表现出轻微的OH清除活性，这可能是由于环状分子固有的环应变引起的此外，两种典型的芳烃溶剂，苯和甲苯，以及三种卤代烃，四氯化碳、氯仿和氯甲烷也具有中等活性。芳烃分子含有共轭π键，其稳定性不如σ键，并且可以与OH自由基反应。然而，三种卤代烃的轻微活性可归因于极性C–X σ键（X=卤素）。
（3）另外三种溶剂，乙腈、丙酮和二硫化碳，表现出较强的羟自由基清除能力。这些分子中的非共轭不饱和键（C≡N，C=O和C=S分别）比芳香烃分子中的共轭π键。因此，它们很容易被羟基自由基破坏。
（4）在7个细胞中观察到非常强的OH清除活性有机溶剂，包括乙醚、DMF(二甲基甲酰胺)、DMSO(二甲基亚砜)、乙醇、乙酸乙酯、甲醇和四氢呋喃。乙醚除外（仍然很可溶），所有这些溶剂都与水所有这些溶剂都包含至少一个O原子，其中形成各种活性化学键（例如C–O、H–O和S=O)或官能团（例如羟基、酯、酰胺、亚砜基和环状乙醚基团）。这些反应性化学键或官能团。对这些溶剂具有强大的羟基自由基清除能力。重要的是，DMSO，它通常用于生物化学或动物实验的样品溶液制备，显示出非常强的清除能力（IC50=5.76±0.76μL）。结果与先前的研究一致，表明DMSO可以作为羟基清除剂，并可以防止羟基自由基对DNA的损伤。
溶剂对测定结果的影响源于有机溶剂本身的羟基自由基清除能力，并且可以最终归因于羟基的极端反应性能。羟基自由基将与周围的溶剂分子快速反应。例如，OH与乙醇和DMSO的反应速率分别为1.9 ⅹ109 L mol -1 s-1和9ⅹ 109 Lmol -1 s-1。OH与DMSO反应的产物为•CH3。
总之，在通过脱氧核糖降解测定进行测量之前，应完全去除任何有机溶剂，否则结果将毫无意义。然而，蒸发温度应保持在60℃以下，以防止抗氧化剂样品正在被摧毁。在我们的
实验中，我们发现所有样品残留物都可以很好地溶解在水反应系统中。最抗氧化剂是有机化合物及其水溶性通常不足以制备样品储备溶液（室温），但通常高到足以溶解在反应系统（50 ℃）。例如，儿茶素的水溶性为2.26 mg/mL（25℃）。而其IC50值仅为0.20±0.0025 mg/mL一些典型的脂溶性抗氧化剂（如BHA、麝香草酚和生育酚）和两种提取物（MEA和MEGB）也可以溶解在反应系统中。这是因为：（1）这些抗氧化剂含有酚-OH基团，可以与H2O分子形成氢键，增加水溶性；（2） 较高的反应温度（50℃）增加了水体系中的溶解度；（3）抗氧化剂残留量逐渐减少反应过程中的•OH攻击。
基于以上讨论，脱氧核糖降解试验可以改进如下：首先，我们选择合适的有机溶剂制备样品溶液。将一小份样品溶液置于管中，并将该样品溶液蒸发至干燥（水浴，60℃）。然后，按照上述测定样品残留量。改进的脱氧核糖降解试验的整个过程如图1所示。
必须强调的是，（1），如果抗氧化剂样品水溶性不好，我们可以用水（或缓冲液）制备样品解决方案因为水（或缓冲液）不能和羟基反应自由基、水溶液样品可以直接测量；(2)如果抗氧化剂样品是热敏的，则样品溶液应在室温下蒸发至干燥。
改进的脱氧核糖测定程序通过使用参考化合物（+）-儿茶素。（+）-儿茶素的回归方程相
关系数（R）为0.99887。IC50的RSD%为0.51%，符合FDA(美国食品药品监督管理局)要求。除（+）-儿茶素外，其他24种抗氧化剂也表现出良好的线性（R=0.80304–0.99956，平均R值为0.93335）和较低的RSD值（0.35–9.07%，平均值为3.38%）。显然，改进后的方法具有良好的线性和精密度。此外，在不同的日期获得的IC50值的RSD%为2.26%。（+）-儿茶素分析这表明改进的方法具有良好的再现性。综上所述，改进的脱氧核糖测定法（尤其是样品制备）是合理可行的。
如图5所示，25种选定的抗氧化剂包括所有类型的抗氧化剂，如纯化合物和提取物；天然和合成；外源性和内源性，水溶性和脂溶性、维生素、维生素类似物和非维生素、酚、多酚、酚酸、类黄酮、原花青素、苯丙素、多肽、杂环酚和碱基对。作为所有这些的清除能力在我们的实验中可以成功地测量物种，改进的方法证明适用于所有类型的抗氧化剂。
【结论】
在脱氧核糖降解试验中，任何有机溶剂测量前应完全蒸发，否则结果将毫无意义。我们提出的改进方法被认为是一种可靠的羟自由基清除试验，适用于所有类型的抗氧化剂。
参考文献
[1] Li, X.C. Solvent effects and improvements in the deoxyribose degradation assay for hydroxyl radical-scavenging. Food Chem. 2013, 141, 2083-2088. DOI 10.1016/j.foodchem.2013.05.084
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议