2.1 实验目的
（1）学习由于了解SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法。
（2）通过垂直板SDS-PAGE对某一蛋白质样品分子量的测定，熟悉和掌握用该方法测定蛋白质分子量的具体实验操作和应用。 2.2实验原理
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是利用样品分子的大小而进行分离的一种变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法。
（1）SDS（十二烷基苯磺酸钠）是一种阴离子去污剂，可使蛋白质分子变性、解聚和伸展。由于SDS分子本身有强的负电荷，能够与变性蛋白质分子所暴露的疏水区大量结合，从而使蛋白质分子带上大量负电荷，这样可以抵消不同蛋白质分子在电泳时的电荷差异。因此，当采样加有SDS的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳时，由于聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应，可以利用蛋白质分子的分子量大小差异对其进行分离，并且可以应用于蛋白质分子量的测定。
（2）在SDS-PAGE进行蛋白质分子质量测定的方法中，利用某些已知分子质量的标准指示蛋白质(Marker)与被测蛋白质样品同时进行电泳比较，根据蛋白质的电泳相对迁移率Rm在一定范围内与其分子质量的对数所呈的线性关系来测定样品中蛋白质的分子质量。注:1、标准指示蛋白质与被测蛋白质样品在电泳前需经含有还原剂的SDS样品处理处理，因此，用该方法测得的是蛋白质亚基的分子质量(对于分子构型异常的蛋白质误差较大)。
2、SDS聚丙烯酌胶凝胶电泳可以采用圆盘电泳的形式，也可以采用垂直平板电泳的形式，其原理相同，只是操作步骤有些不同。另外，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳亦分为不连续系统和连续系统，不连续系统具有与PAGE原理相同的样品堆集浓缩效应，灵敏度较高；连续系统操作相对简便，这些可以根据教学条件和应用需要进行主择。 3、本实验采用垂直平板以不连续系统的SDS-聚丙烯酷股凝胶方式进行电泳。垂直平板电泳的优点在于在一块凝胶平板上可以同时进行多个不同样品的电泳，因此条件一致，更加便于分析比较，并方便开展延伸的Western Blotting、双向电泳等分析。
2.3 仪器与耗材sds聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.3.1实验仪器
（1）垂直板电泳槽装置4套（可共8小组，24人同时进行实验）（植物实验室，需要补充3套）
（2）电动脱摇床8台（植物实验室，需要补充7台）
（3）电泳仪电源1台（植物实验室，需要补充1台）
（4）凝胶成像扫描系统1套（植物实验室，需要补充1套）
（5）光波炉2台（植物实验室，需要补充2台）
（6）万分之一电子天平1台
（7）涡旋混合器2台（植物实验室，需要补充2台）
2.3.2实验耗材
（1）可调移液（3支，5~20μL、50~200μL、1000μL各一支）
（2）医用注射器8支（5ml，带针头）
（3）移液管4支（1ml，5ml各2支）
（4）烧杯（100ml，4个；50ml4个，1000ml4个）
（5）量筒（100ml，1个；1000ml1个）
（6）吸水纸（4卷）
（7）标签纸（2张）
（8）移液管架（4个）
（9）洗耳球（4个）
（10）培养皿（φ9cm，16套）
（11）记号笔4支
2.4试剂与配制
2.4.1实验试剂
1)丙烯酿胶（Acr）。
2)甲叉双丙烯酷胶(Bis)。
3)过硫酸铵（AP）。
4)四甲基乙二胺(TEMED)（有毒，保险柜按需领取）。
5)三羟甲基氨基甲烷(Tris) 。
6)考马斯亮蓝G250\R250。
7)十二烷基苯磺酸钠(SDS)。
8)β-疏基乙醇（有毒，保险柜按需领取）。
9)甘氨酸(Gly) 。
10)溴酚蓝。
11)甘油。
12)浓盐酸（有强腐蚀性，保险柜按需领取）。
13)琼脂糖。
14)甲醇。
15)冰醋酸（冰乙酸）。
16)牛血清白蛋白(BSA)（分子量: 66 200Da）。
17)中分子量标准蛋白（分子量范围：14KDa~94KDa）
2.4.2试剂配制
1）丙烯酰胺(Arc)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)溶液的配制。
分别称取Arc 30g，Bis0.8g于烧杯中，先用约80mL蒸馏水溶解，然后用蒸馆水定容至100.0mL，混匀即可。注：溶解后如有絮状物，可用垫有脱脂棉的小漏斗滤去。
2）十二烷基苯磺酸钠(SDS)溶液的配制
称取SDS 2.0g于烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，然后用蒸馆水定容至20.0mL，混匀即可。注：如不易溶解，需温水浴加热溶解，SDS低于10℃易析出。
3）10%过硫酸绞(AP)溶液的配制
称取AP 1.0g于烧杯中，加蒸馏水10mL溶解，混匀即可。
4）1. 5mol/L，pH 8.8 Tris-HCl Buffer的配制
称取Tris 18. 2g于烧杯中，先用蒸馏水约80mL溶解，然后用浓盐酸调至pH8.8，最后用蒸馏水定容至100mL，混匀即可。注：必须用酸度计精确测量，保证pH准确，否则容易导致分离胶不凝。
5）1. 0mol/L，p日6. 8 Tris-HCl Buffer的配制
称取Tris 6. 0g于烧杯中，先用蒸馏水40mL榕解，然后用浓HCl调至pH 6.8，用蒸馏水
定容至50mL，混匀即可。注：必须用酸度计精确测量，保证pH准确，否则容易导致浓缩胶不凝。
6）pH 8.3Tris Giy电极缓冲液的配制
分别称取Tris 3.0g，Gly 14.4g，SDS 1.0g于烧杯中，先用适量蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1000. 0mL，混匀即可。
7）四甲基乙二胶(TEMED)，用时直接取原液。
8）2%琼脂糖溶液的配制
称取琼脂糖1. 0g于烧杯中，加蒸馏水50mL，需要使用时在微波炉(或电炉)上加热至近沸腾溶化。
9）0.05%溴酚蓝溶液的配制
称取溴酚蓝25.0mg，加蒸馏水50mL溶解，混匀即可。
10)样品溶解缓冲液(Buffer溶液)的配制
1.0mol/L，pH 6. 8 Tris-HCl Buffer 0.5mL
甘油0.8mL
10% SDS 1.6mL
β-琉基乙醇(β-EtSH) 0.4mL
0.05溴酚蓝0.2mL
蒸馏水(DDW) 4.5mL
总体积8.0mL
11)样品溶液的配制(1. 0mg/mL)
称取牛血清白蛋白(BSA)1. 0mg，加样品溶解缓冲液1. 0mL，溶解混匀即可，沸水浴5min 后迅速冷却。
注：样品要完全溶解，含盐量要尽可能低。
12）标准品溶液的配制
标准分子质量Marker(一小瓶)加样品洛解缓冲液200µL，溶解混匀即可，沸水浴5min 后迅速冷却。
13）染液的配制
称取考马斯亮蓝G250250mg于烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，然后分别加入冰醋酸9.0mL，甲醇45.5mL，最后用蒸馏水定容至100mL，混匀即可。
14）脱液的配制
冰醋酸：甲醇：水=7.5 : 5.0 : 87.5(体积比)。
2.5实验步骤
2. 5. 1凝胶液的配制
分离胶及浓缩肢的配制见表2-1
表2-1 SDS-PAGE分离胶及浓缩胶的用量及配制(学生实验选用B方案用量配制)
12%分离胶A方案用量：30ml B方案用量：8ml
蒸馏水9.8ml 2.6mL
30%Acr-Bis 12.0ml 3.2mL
1.5mol/L Trist-HCl（pH8.8）7.6ml
2.0mL
10%SDS 0.3ml 0.08mL
10%AP 0.3ml 0.2mL(原0.08mL) TEMED 0.012ml 3.2µL
5%浓缩胶A方案用量：16ml B方案用量：4ml
蒸馏水11ml 2.75mL
30%Acr-Bis 2.6ml 0.65mL
1.5mol/L Trist-HCl（pH8.8）
2.0ml 0.5mL
10%SDS 0.16ml 0.04mL
10%AP* 0.16ml 0.lmL(原0.04mL) TEMED* 0.016ml 4µL
核黄素** 2mg 1mg
注：（1）A方案为大型电泳槽用量；B方案为小型电泳槽用量；
（2）*可通过适当调整引发剂10%AP和加速剂TEMED的用量，来调整凝胶的聚合时间在30min~60min。
（3）**核黄素为引发剂，用可见光或紫外光（波长253．7毫微米）照射，可促进浓缩胶聚合。
2. 5. 2垂直平板电泳槽的装配
1)将洁净的垂直平板电泳槽水平放置，在槽内凹型平面上(或在此平面上另加凹型玻璃
板平面上)两侧边各垫加一块配套的Imm厚隔条(隔条厚度决定凝胶夹槽的厚度)，再在两块边条上对应
整齐加上玻璃平板以形成凝胶夹槽，对合到位后，在槽的两竖侧边分别用两只夹子将玻璃板与电泳槽夹紧，以使两边密封(此后需小心拿取电泳槽)。2)将电泳槽竖立，用滴管吸取适量经微波炉(或电炉)加热至近沸腾洛化的2 %琼脂糖溶
液，趁热灌注于玻璃平板的底槽，待琼脂糖冷却凝固后，底层即封闭(需避免气泡)。
3)在玻璃平板夹槽内用注射器(或滴管)加满蒸榴水，并观察两侧和底部是否有渗漏现
象，如有渗漏则需要重新安装玻璃平板槽。确保无渗漏后，轻轻倒去夹槽蒸馏水，并用吸水纸吸去夹槽内残留的蒸馏水。
关于其他类型垂直平板电泳槽见相关说明书进行装配。
2.5.3分离胶的制备
(1)用带有长针头的注射器吸取分离胶混合贮液，慢慢注入垂直放好的平板夹槽，直至胶液高度为7cm。
(2)用另一带细针头注射器吸取适量蒸馏水，缓慢在胶面上仔细加注厚0.5~1.0cm的蒸馏水层(即封水)，在室温下静置40~60min进行聚合，这时可根据界面现象进行辨别。开始时，槽内胶层与水层界面渐至
扩散消退，待固体凝胶形成后，又将可辨。当有明显的水平分层界面现象出现时，表明凝胶已聚合完毕。
(3)聚合后将上层的封水轻轻倒掉，并用吸水纸吸去槽内胶层上残留的蒸馏水(不要触及胶面)。
2.5.4浓缩胶的制备
(1)将混合好的浓缩胶贮液用带有针头的注射器吸取加注到分离胶胶面上，直至高度约为2cm。
(2)将加样梳板的梳齿插入平板顶部夹槽内，并保证梳齿的2/3部分浸没在浓缩胶液内(如高度不够，可适量添加贮液)，在室温下，静置40~60mino(如果浓缩胶面不用加样梳板，则可加水层封水以便界面平整，此方法为只加一种样品作制备等用)。
(3)浓缩胶聚合后，将加样梳板轻轻垂直地从顶槽内取出，这时即可出现一个个齿孔(即加样凹槽)。用小滤纸条吸去齿孔内残液，但不能触及和移动胶齿。用滴管吸蒸馆水清洗加样齿孔2遍，每次用小滤纸条吸去齿孔内残液。
14. 5. 5加标准品和样品溶液
1)加样量
用微量注射器吸取：
(1)标准品Marker溶液(200µL/小瓶) 10µL/齿孔。
(2)样品溶液（1.0mg/mL）2.5µL/齿孔。
2)加样方法(有两种方法，可选一种)
(1)先加样，后加电极溶液
用微量注射器分别小心将样液加注到平板槽内的加样齿孔内（记录每孔内所加的样品，各孔内的样品不能相混)，加样完毕后，将准备好的电极溶液分别轻轻倒入上、下电极槽内，特别是在加注上电极榕液时，一定要沿槽内壁轻轻加入，以防冲动各齿孔内的样品液引起相互混合和扩散。
(2)先加电极溶液，后加样
也可先将上、下电极槽内加注电极溶液后，再用微量注射器将针头伸入在上槽各自的加样齿孔底部轻轻加样，这样可以避免在加电极液时引起样品溶液相互混合和扩散。
2.5. 6电泳
加完样品和电极液后(电极一定要漫入电极溶液内)，连接电泳槽导线至电泳仪，上电极接电泳仪负极，下电极接电泳仪正极，开启电泳仪，使电流调整至15mA/cm2(凝胶顶部截面积)，电泳15min后，再调整电流至30mA/cm2（150~250V电压）继续电泳，待溴酚蓝指示前沿到达下端（约1cm）时，关闭电泳仪，停止电泳。
2.5.7分离区带鉴定
豫公网安备41160202000603
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