实验⼗聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋⽩质 实验⼗聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋⽩质【实验⽬的】
1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；
2. 掌握⽤此法分离蛋⽩质组分的操作⽅法。
【实验原理】
在⽣物化学、分⼦⽣物学和基因（遗传）⼯程实验中，常常要进⾏蛋⽩质和核酸的分离⼯作。聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为⽀持介质进⾏蛋⽩质或核酸分离的⼀种电泳⽅法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作⽤下聚合交联⽽成的三维⽹状结构的凝胶。通过改变单体浓度与交联剂的⽐例，可以得到不同孔径的凝胶，⽤于分离分⼦量⼤⼩不同的物质。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采⽤过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基⼄⼆胺（简称TEMED）。通常控制这⼆种溶液的⽤量，使聚合在1⼩时内完成。（2）光聚合：通常⽤核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加⼊TEMED 加速反应。
聚丙烯酰胺凝电泳常分为⼆⼤类：第⼀类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第⼆类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。
⼀般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）；②凝胶的分⼦筛效应（凝胶的⽹状结构及电泳物的⼤⼩形状不同所致）。③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。因此，样品分离效果好，分辨率⾼。 SDS即⼗⼆烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离⼦表⾯活性剂，它能以⼀定⽐例和蛋⽩质结合，形成⼀种SDS-蛋⽩质复合物。这时，蛋⽩质即带有⼤量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从⽽使天然蛋⽩质分⼦间的电荷差别降低仍⾄消除。与此同时，蛋⽩质在SDS作⽤下结构变得松散，形状趋于⼀致，所以各种SDS-蛋⽩质复合物在电泳时产⽣的电泳迁移率的差异，仅仅取决于蛋⽩质的分⼦量。另外，SDS-蛋⽩质复合物在强还原剂（巯基⼄醇）存在下，蛋⽩质分⼦内⼆硫键被打开，这样分离出的谱带即为蛋⽩质亚基。当分⼦量在15KD到200KD之间时，蛋⽩质的迁移率和分⼦量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分⼦量，X为迁移率，k、b均为常数。
本实验采⽤化学聚合法制胶，进⾏不连续的凝胶电泳，并⽤考马斯亮蓝快速染⾊，以分离和鉴定⼤肠杆菌菌体、发酵液中和纯化的蛋⽩产物。
【试剂与器材】
（⼀）试剂（(全班分两⼤组，每组配⼀份，如1－5组⼀份，6－10组⼀份)
（1）30% 的凝胶贮备液：ACR 30g + Bis 0.8g 溶于100 mL去离⼦⽔中，⽤3号新华滤纸过滤⾄棕⾊瓶中，4℃避光贮存（1）。
（2）3mol/L Tris-buffer,pH8.9：Tris base 36.6 g + 1 mol/L HCl 48 mL + ddH?O ⾄100 mL）
（3）0.5mol/L Tris-HCl, pH6.8 : 6.05g Tris base 溶于40mL ddH?O中，加1mol/L HCl 48mL, 加⽔补⾄100mL.
（4）5×Tris-⽢氨酸电泳buffer（pH8.3):（配1L）
Tris-base 15.1g + ⽢氨酸94g + 5g SDS + H2O⾄1L（⽤时稀释5倍）。
（5）10% SDS:：称10克SDS溶解于100mL去离⼦⽔中，贮存于室温中。
（6）TEMED（四甲基⼄⼆胺）：浓度10%，20 mL (全班共⽤)，4℃保存。
（7）10% AP（过硫酸铵）：10 mL，新鲜配制，分装⾄1.5mL 离⼼管中，－20℃保
存待⽤（2）。
（8）样品溶解液：内含1% SDS，1%巯基⼄醇，40%蔗糖或20%⽢油，0.02%溴酚蓝，0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL缓冲液。
* 先配制0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液：称Tris 0.6g ，加⼊50 ml重蒸⽔，再加⼊约3 ml 1mol/L HCL，调pH⾄8.0，最后⽤重蒸⽔定容⾄100 ml
*按下表配制样品溶解液：
*如样品为液体，则应⽤浓⼀倍的样品溶解液，然后等体积混合。
*或配制2 X SDS样品缓冲液：
100mmol/L Tris-HCl (pH6.8)
200mmol/L DTT
4% SDS
0.2% 溴酚蓝
20% ⽢油
必要时加⼊少量（1%）巯基⼄醇。
（9）考马斯亮蓝染⾊液(3)：0.05 g考马斯亮蓝R250溶于25 mL异丙醇⾥，加11 mL冰醋酸+H2O ⾄110 mL，⽤滤纸过滤除去不溶物。
（10）0.1%溴酚蓝指⽰剂（全班共⽤）
（11）脱⾊液：75 mL冰⼄酸+ 50 mL甲醇+ 875 mL H2O（若只配500 mL，各物质减半）
（⼆）器材
①电泳仪②垂直板电泳槽，电泳板
③微量进样器（50µL）④染⾊/脱⾊摇床。
【操作⽅法】
1.胶板模型的安装：在⼲净的凹形玻璃板的三条边上放好塑料条（有些型号的电泳板已有固定的隔板），然后将另⼀块玻璃板压上，⽤夹⼦夹紧（或装在制板模型中），在两块板之间滴上热融的10 ％
琼脂糖凝胶封边（4）。
2.分离胶的制备[10 ml，可供两块板( 11cm x10 cm)使⽤]
⽤⼿轻摇混匀, ⼩⼼将混合液注⼊准备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留⾜够的空间（～2.5cm），轻轻
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳
在顶层加⼊⼏毫升去离⼦⽔覆盖，以阻⽌空⽓中氧对凝合的抑制作⽤。
刚加⼊⽔时可看出⽔与胶液之间有界⾯，后渐渐消失，不久⼜出现界⾯，这表明凝胶已聚合。再静置⽚刻使聚合完全，整个过程约需30分钟（25℃室温）。
3.浓缩胶的制备：先把已聚合好的分离凝胶上层的⽔吸去，再⽤滤纸吸⼲残留的⽔液。按下列配⽅制备各种体积的浓缩胶溶
液：
混合后将其注⼊分离胶上端，插⼊梳⼦，⼩⼼避免⽓泡的出现。
4.在浓缩胶聚合的同时，将蛋⽩样品与2x样品缓冲液等体积混合，置沸⽔或微量恒温器（100℃）中加热3分钟，马上插⼊冰上冷却待⽤。
5.浓缩胶聚合完全后，将凝胶模板放⼊电泳槽上固定好，上下槽均加⼊1X电泳缓冲液，⼩⼼地拔出梳⼦，⽤移液器冲洗梳孔，检查有⽆漏，并驱除两玻璃板间凝胶底部的⽓泡。
6.按次序上样：⽤微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，所加样品混合液体积要根据样品蛋⽩浓度⽽定，⼀孔加⼀个样品，同时⽤已知分⼦量的标准蛋⽩作对照。
本实验系统中需要分离鉴定的是纯化的GFP蛋⽩，点样样品和次序包括：
蛋⽩Marker
pUC18细菌总蛋⽩
pGFP未诱导总蛋⽩
pGFP加Glu及IPTG诱导总蛋⽩
pGFP加IPTG诱导破菌后上清总蛋⽩
层析时的穿流峰（杂蛋⽩）
层析时的洗涤峰I
层析时的洗涤峰II
GFP对照
7.电泳：开始时电压为5～8V/cm（约100V）凝胶，待染料浓缩成⼀条线开始进⼊分离胶后，将电压增到10～12V/cm（约180V）凝胶，继续电泳直到染料（溴酚蓝）抵达分离胶底部，断开电源。8.剥胶：取下胶板，从底部⼀侧轻轻撬开玻璃板，⽤⼿术⼑切去浓缩胶，并切去⼀⼩⾓作记号。
9.固定及染⾊：取下凝胶放⼊⼤培养⽫，⽤考马斯蓝染⾊液染⾊并固定，最好放在摇床缓慢旋转1-2⼩时。
10.脱⾊：先⽤⽔洗去染料，再放⼊脱⾊液中浸泡，更换脱⾊液3-4次，约4-8⼩时或过夜。
11.将脱⾊后凝胶中的蛋⽩质分离⾊带照相或⼲燥，也可⽆限期地⽤塑料袋封闭在含20%⽢油的⽔中。
【注意事项与提⽰】
（1)丙稀酰胺和甲叉双丙稀酰胺具有神经毒性，因此称量时要戴⼿套。两者聚合后即⽆毒性，但为避免接触少量可能未聚合的单体，所以建议在配胶和制板过程中都要带上⼿套操作。另外，配好的溶液之所以要避光保存，是因为此溶液见光极易脱氨基分解为丙烯酸和双丙烯酸。
（2）过硫酸铵极易吸潮失效，因此要密闭⼲燥低温保存。配好的10％过硫酸铵要分装冷藏。
（3）考马斯亮蓝R-250(三苯基甲烷）染⾊: 每分⼦含有两个SO3H 基团，偏酸性，结合在蛋⽩质的碱性基团上。与不同蛋⽩结
合呈现基本相同的颜⾊。检测灵敏度约为0.2－0.5ug。也可⽤银染⾊：将蛋⽩带上的硝酸银还原成⾦属银、以使银颗粒沉积在蛋⽩带上。此法⽐考马斯亮蓝灵敏两个数量级，但步骤较复杂。
（4）制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为⼆块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留⼼操作。有些型号的电泳板可在模型中直接安装，免去了封边和拆边的⿇烦，还可以同时制备多块凝胶。
（5）AP和TEMED是催化剂，加⼊的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚⾄不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。为避免过快聚合，可将加了催化剂的凝胶先放在冰中。
（6）加热使蛋⽩质充分变性。
（7）⽤移液器冲洗梳孔可将空中的凝胶除去，以免点样孔不平齐或影响蛋⽩样品的沉降。
（8）两玻璃板间凝胶底部的⼤⽓泡可阻断电流，因此必须除去。
（9）总量⼀般不超过20µl，如果点样量太多溢出梳孔，就会污染旁边泳道。要根据样品浓度来加样品溶解液。每点⼀个样品后换⼀⽀吸头或清洗吸头后再点另⼀个样品。
（10）电泳时间要依据所⽤电压及待测蛋⽩分⼦量⼤⼩⽽定。
（11）电泳完毕撬板取凝胶时要⼩⼼细致，不能在凹形板双⽿处撬，也不能⽤死⼒弄坏玻璃板。（12）考马斯亮蓝染⾊液盖过凝胶即可，染⾊后染⾊液要回收，可重复使⽤多次。
（13）脱⾊过夜可使背景更⼲净，谱带更清晰。
【实验安排】
本实验试剂配制和电泳可在⼀天内完成，各⼩组要在上午配好试剂并做好胶，中午或下午即可开始电泳。
【实验报告要求与思考题】
1．就实验中出现的各种问题进⾏分析讨论。
2．在不连续体系SDS-PAGE中，当分离胶加完后，需在其上加⼀层⽔，为什么?
3．在不连续体系SDS-PAGE中，分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP，试述其作⽤。
4．根据下式计算标准蛋⽩和待测样品的电泳迁移率，然后以标准蛋⽩的相对迁移率为横坐标，其分⼦量的对数为纵坐标作标准曲线图，根据标准曲线图准确计算待测蛋⽩的分⼦量。粗略估计待测蛋⽩分⼦量的⽅法是直接根据凝胶上的分⼦量标准进⾏估算。
5．为什么样品电泳前要⾼温加热？
6．进⾏凝胶电泳时应如何选择样品点样，设置对照？
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