第49卷第1期2021年1月广㊀州㊀化㊀工
Guangzhou Chemical Industry
Vol.49No.1Jan.2021
dsDNA 修饰Ag -Thi -nGO 电极作为生物 李㊀洁，陈慧敏，张冰聪，俞家琪，程㊀琼
(嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江㊀嘉兴㊀314001)
摘㊀要：电化学Ag -Thionine -nGO 电极的表面用鲑鱼精子双链DNA(dsDNA)修饰以检测吉非替尼(Gefitinib)靶向药物与
DNA 的相互作用㊂采用差分脉冲伏安法研究Gefitinib 的电化学分析过程，并评估其与固定在电极表面的dsDNA 的相互作用㊂操作参数优化后，峰电流与Gefitinib 浓度在0.10ˑ10-5~10.00ˑ10-5mol /L 范围内线性关系良好㊂
关键词:Ag -Thionine -nGO；双链DNA 生物传感器；吉非替尼；修饰电极㊀中图分类号:Q625
㊀文献标志码:A
文章编号:1001-9677(2021)01-0027-05
㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀
∗
基金项目：嘉兴学院校级重点大学生创新训练计划项目(85178559)㊂第一作者：李洁(1998-)，女，本科生㊂
通讯作者：程琼(1964-)，女，博士，教授，主要研究方向为电化学生物传感器㊂
dsDNA Modified Ag -Thi -nGO Electrode as Biosensor for Detection of Gefitinib ∗
LI Jie ,CHEN Hui -min ,ZHANG Bing -cong ,YU Jia -qi ,CHENG Qiong
(School of Biological and Chemical Engineering,Jiaxing University,Zhejiang Jiaxing 314001,China)
Abstract :The surface of the electrochemical Ag -Thionine -nGO electrode was modified with salmon sperm double -stranded DNA (dsDNA)to detect the interaction of Gefitinib -targeted drug with DNA.The electrochemical analysis of Gefitinib was studied by differential pulse voltammetry and its interaction with dsDNA immobilized on the electrode surface was evaluated.After the optimization of the operating parameters,the peak current and the Gefitinib concentration had a good linear relationship in the range of 0.10ˑ10-5~10.00ˑ10-5mol /L.
Key words :Ag -Thionine -nGO;double -stranded DNA biosensor;Gefitinib;modified electrode
吉非替尼(Gefitinib)是世界上第一个表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，能阻断肿瘤细胞生长和进展的关键过程，是肺癌的靶向药物㊂在亚洲临床研究报道中，能显著延长患者的生存时间[1]，有效改善患者的症状[2-3]㊂Gefitinib 的成功表明，了解肺癌的基本机制对发展更好的方法而言至关重要㊂但大剂量应用，会影响正常的人体细胞，危及内脏器官，并产生一系列副作用㊂因此，有关于检测抗癌药物含量和残留的问题正受到越来越多的关注㊂
现如今的检测方法大多需要使用昂贵的分析仪器，而且程序繁琐，分析成本高㊂因此开发价格低廉，检测便捷的分析方法就显得尤为重要，电化学方法因其操作简单，电化学响应快速，检测灵敏度高等优点，具有较高的实用价值㊂而生物传感器是生物学与物理化学检测器相结合，用于电活性物的检测， 具有较高的选择性和灵敏性[4]㊂利用DNA 与电活性物的相互作用而制成生物传感器，检测药物分子的含量，是一种全新的思路，已成为新的研究热点㊂
石墨烯在材料领域表现出优异的导电性能，使电子快速转移，用作修饰电极在电化学检测中表现出高灵敏度和高选择性等优点，本文将石墨烯纳米银复合材料相结合，通过构建DNA 生物传感器，测定抗肿瘤靶向药物吉非替尼㊂
1㊀实㊀验
1.1㊀材料和仪器
材料：纳米石墨烯片(GO),Aladdin 公司;
试剂：鲑鱼精子双链DNA,Amresco 公司；吉非替尼(Gefitinib),Sigma 公司;N -羟基琥珀酰亚胺(NHS)㊁1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)㊁硫堇(Thionin)㊁乙醇㊁硼氢化钠㊁Aladdin 公司；硝酸银，上海试剂一厂；铁㊁氯化钾㊁甲醇㊁乙酸㊁无水乙酸钠㊁磷酸二氢钠㊁磷酸氢二钠㊁碳酸钠㊁碳酸氢钠㊁氢氧化钠㊁聚乙二醇4000，国药集团化学试剂有限公司㊂实验过程中所用试剂均为分析纯，其中鲑鱼精子双链DNA 为生化试剂，实验用水为二次水㊂
仪器:CHI842B 电化学工作站，上海CHI 公司；玻碳电极㊁Ag -AgCl 参比电极㊁铂电极;BSA1243电子
天平，赛多利斯科学仪器有限公司;KQ -200KDE 超声仪，昆山市超声仪器有限公司;RCT 基本-2磁力搅拌器,IKA 公司;TG1650-WS 高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司;DZG -6020真空干燥箱，上海森信实验仪器有限公司;THZ -82恒温振荡器，金坛市万华实验仪器厂㊂
28㊀广㊀州㊀化㊀工2021年1月
1.2㊀修饰电极的制备
1.2.1㊀羧化nGO
称取100mg 的nGO(纳米氧化石墨烯)，并通过超声波将其均匀分散在10mL 蒸馏水中，得到均匀的nGO 悬浮液(10mg /mL)㊂将EDC(0.1moL /L,10mL)和NHS(0.1mol /L,5mL)滴加到上述nGO 悬浮液(10mg /mL)中，加入HCl (0.2M)将pH 调节至6.0，在恒温震荡器上(20ħ)震荡反应1h㊂通过离心(7000rpm,5min)纯化获得的羧化nGO 悬浮液，用蒸馏水洗涤3次㊂
1.2.2㊀硫堇功能化nGO 的合成
将硫堇溶液(0.5mg /mL,15mL)滴加到羧化的nGO 水分散体中[5]，用NaOH(0.2M)将溶液pH 调节至8.0，在恒温震荡器(20ħ)上震荡反应4h㊂硫堇偶联后，用去离子水洗涤并以7000rpm 离心6min 来纯化产物，离心三次㊂1.2.3㊀纳米银颗粒的合成 制冰水浴，在剧烈搅拌下，在烧杯中将AgNO 3水溶液(0.001M,7mL)逐滴加入到NaBH 4水溶液(0.01M,25mL)中，反应30min，精确控制时间㊂制备得到亮黄澄清溶液，即纳米银粒子溶液[6]㊂
1.2.4㊀Ag -Thionine -nGO 纳米复合材料的合成agagcl参比电极
将硫堇功能化nGO 混合物和纳米银粒子溶液混合，在恒温震荡器(20ħ)上震荡反应24h㊂反应完成后，通过离心(7000rpm,6min)分离固体产物，产物用甲醇和去离子水洗涤数次，然后在60ħ下真空干燥24h㊂
1.2.5㊀Ag -Thionine -nGO 纳米复合材料玻碳电极的制备
将玻碳电极用Al 2O 3粉末进行表面处理,Al 2O 3粉末按500nm 在抛光布上使用，同方向研磨15min㊂取适量的Ag -Thionine -nGO 于离心管中加入适量的DMF 溶液，混匀，备用㊂取适量混合液滴加到玻碳电极上，自然晾干㊂再滴加Nafion 溶液(8μL)，自然晾干
㊂
图1㊀Ag -Thionine -nGO 纳米复合材料的合成Fig.1㊀Synthesis of Ag -Thionine -nGO Nanocomposites
第49卷第1期李洁，等:dsDNA 修饰Ag -Thi -nGO 电极作为生物传感器检测吉非替尼
29
㊀1.2.6㊀dsDNA 的固定
在5mL 含有16mg /L dsDNA 的0.2M 乙酸盐缓冲液(pH 4.0)中，在电位为+0.50V,200rpm 搅拌条件下，将dsDNA 固定在修饰好的Ag -Thionine -nGO 纳米复合电极上，然后用蒸馏水冲洗电极㊂
1.2㊀电化学检测
电极表面固定dsDNA 后，在含有Gefitinib 的pH 4.0的0.20M 乙酸盐缓冲液中进行灵敏检测，用差分脉冲伏安法(DPV)检测其电流值㊂DPV 研究的优化操作条件为：初始电位为-0.3V，终止电位为0.3V，电位增量为0.004V，振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期为0.2s，静置时间为2s㊂
在扫描速率为100mV㊃s -1的条件下，在-100~600mV 范围内记录在PBS(pH 7.4)和KCl(0.50M)混合溶液中K 3[Fe(CN)6](2.0mM)的循环伏安图㊂
2㊀结果与讨论
2.1㊀Ag -Thionine -nGO 纳米复合材料的表征
2.1.1㊀循环伏安法表征dsDNA 包被的Ag -Thionine -nGO 电极
为了研究在Ag -Thionine -nGO 表面上dsDNA 的固定，以
Fe(CN)3-6/Fe(CN)4-6氧化还原对作为指示剂，用循环伏安法(CV)扫描检测(反应底液：含有0.50mol /L KCl 和2.0ˑ10-3mol /L K 3[Fe(CN)6]的pH 7.4的0.2M 磷酸盐缓冲液)㊂该指示剂的操作基于氧化还原对和带负电荷的DNA 磷酸骨架之间的静电排斥㊂如图2所示，在裸露的玻碳电极上,K 3[Fe(CN)6]的伏安图表征为一对峰值明确的峰，阴极峰电位(Epc)为169mV，阳极峰电位(Epa)为368mV，峰-峰电位分离(Ep)为199mV(曲线b)㊂另外，当使用Ag -Thionine -nGO 纳米复合材料修饰电极时，电流增加(曲线c)㊂在修饰好的电极表面固定
dsDNA 后，观察到Ep 降低，表明Fe(CN)3-6/Fe(CN)6
4-氧化还原对在DNA 上的电化学可逆性降低(曲线a)㊂同时，阴极峰电流和阳极峰电流均下降，这种现象可以做如下描述：在Ag -Thionine -nGO 上固定dsDNA 之后,dsDNA 上带负电荷的磷酸
基团抵抗Fe(CN)3-6/Fe(CN)64-氧化还原对接近电极表面，产生静电排斥[8]㊂因此，这些电极的CV 曲线之间的差异显示了dsDNA 在电极表面上的固定情况
㊂
图2㊀不同电极的循环伏安曲线
Fig.2㊀Cyclic voltammetry curves of different electrodes
2.1.2㊀SEM 分析
用电镜扫描Ag -Thionine -nGO 纳米复合材料，如图3所示，可以观察到石墨烯呈片状，纳米银颗粒分布在石墨烯表
面，这意味着Ag -Thionine -nGO 纳米复合材料合成成功[7]
㊂
图3㊀Ag -Thionine -nGO 纳米复合材料的SEM 图谱Fig.3㊀SEM spectrum of Ag -Thionine -nGO nanocomposites
2.2㊀Gefitinib 与溶液中双链DNA 的相互作用
图4显示了在存在(曲线a)和不存在dsDNA(曲线b)的情况下Ag -Thionine -nGO 检测乙酸盐缓冲液(0.20M,pH 4.0)中Gefitinib 的DPV 图㊂在dsDNA 存在下，由于形成了Gefitinib -DNA 复合物，阳极电
流减少㊂假设这种复合物的扩散速率很小，则Gefitinib 的阳极电流下降归因于未结合的Gefitinib 浓度的降低[9]㊂Gefitinib 与dsDNA 溶液是通过嵌入的方式相互作用的[10]㊂由于Gefitinib 与DNA 相互作用，观察到DNA 存在下的Gefitinib 氧化电流下降㊂在+0.84和+1.16V 电位下检测对应的鸟嘌呤和腺嘌呤基团的DNA 碱基氧化峰，并未出现，这意味着DNA 的双螺旋结构没有改变，未损害
dsDNA㊂
图4㊀Gefitinib 与溶液中双链DNA 的相互作用图Fig.4㊀Interaction diagram of Gefitinib with double -stranded
DNA in solution
2.3㊀Gefitinib 在dsDNA 包被的Ag -Thionine -nGO 表面的电化学行为
分别将裸GCE 电极(曲线a)，硫堇修饰的玻碳电极(曲线b);Ag 纳米颗粒修饰的玻碳电极(曲线c);Ag -Thionine -nGO 电极(曲线d)，以及dsDNA 包被的Ag -Thionine -nGO 电极(曲线e)浸在浓度为4.0ˑ10-5mol /L Gefitinib 的乙酸盐缓冲液
(0.20M,pH 4.0)中,-0.4V 的电位下积累120s，并用蒸馏水洗涤电极，接着转移到乙酸盐缓冲液(0.20M,pH 4.0)中，记录DPV 图，如图5所示㊂如曲线e 所示,Ag 纳米颗粒修饰的玻碳电极的检测信号
明显比裸玻碳电极大，这是由于Ag 纳米颗粒具有良好的电催化活性和导电性能，而最大的阳极信号是在dsDNA 包被的Ag -Thionine -nGO 电极中，这意味着Gefitinib 和固定在电极表面的DNA 层之间存在强烈的相互作用[11](反应条件:Gefitinib 浓度为4.0ˑ10-5mol /L,DNA 固定时间240s，积累介质为pH 4.0的0.2M 乙酸盐缓冲液，积累时间120s，剥离介质为pH 4.0的0.2M 乙酸盐缓冲液)㊂
30㊀广㊀州㊀化㊀工2021年1
月
图5㊀Gefitinib 在dsDNA 包被的Ag -Thionine -nGO 表面的
电化学行为图
Fig.5㊀Electrochemical behavior of Gefitinib on dsDNA
coated Ag -Thionine -nGO surface
2.4㊀实验优化
2.4.1㊀固定时间
使用差分脉冲伏安法(DPV)对比dsDNA 固定时间对积累Gefitinib 的峰电流Ipa 的影响㊂结果所示，固定的DNA 量随着固定时间的增加而增加，大约在240s 后开始降低，说明DNA 的固定已经达到饱和㊂因此,240s 为最佳固定时间(反应底液：含有4ˑ10-5mol /L Gefitinib 的pH 4.0的0.20M 乙酸盐缓冲液
)㊂
图6㊀固定时间的影响
Fig.6㊀The effect of immobilization time
2.4.2㊀
固定电位
图7㊀固定电位的影响
Fig.7㊀The effect of immobilization potential
电位的选择对DNA 的固定十分重要㊂在0.2~0.8的范围
内，使用差分脉冲伏安法(DPV)对比dsDNA 固定电位对积累Gefitinib 的峰电流Ipa 的影响㊂DPV 响应电流的关系如图7所示，最大响应电流值出现在0.5V，电位过高，不利于带负电荷的DNA 固定㊂因此，选用0.5V 作为本实验检测的固定电位(反应底液：含有4ˑ10-5mol /L Gefitinib 的pH 4.0的0.20M 乙酸盐缓冲液)㊂
2.4.3㊀积累底液pH 值
鉴于质子参与了Gefitinib 的氧化，溶液的pH 值对峰电流Ipa 有很大的影响[8]㊂为了考察积累过程底液pH 值对响应电流的影响，配制了不同pH 值的溶液分别进行检测㊂使用差分脉冲伏安法(DPV)对比在3.00~10.00pH 范围内的Gefitinib 电化学氧化，对积累底液pH 值进行优化选择㊂根据图8的结果，峰值电流在pH =4.0处为最大，当pH 大于4.0，电流值随pH 增大而减小，出现这种现象的原因可能是pH 过高,Gefitinib 药物活性降低㊂因此，本实验选用pH 4.0缓冲液作为Gefitinib 的检测溶液(反应底液：含有4ˑ10-5mol /L Gefitinib 的pH 3~10的0.20M 乙酸盐缓冲液
)
㊂
图8㊀积累底液pH 值的影响
Fig.8㊀The effect of accumulating the pH of the base
2.4.4㊀
积累时间
图9㊀积累时间的影响
Fig.9㊀The effect of accumulation time
积累时间决定了Gefitinib 与dsDNA 的相互作用程度㊂dsDNA 包被的Ag -Thionine -nGO 在乙酸盐缓冲液(0.2M,pH 4.0)中对比了积累时间对检测Gefitinib 峰电流的影响㊂如图9所示，在前120s,Ipa 随着积累时间的增加而增加，积累时间过长,Gefitinib 对电极表面产生隔离影响，响应信号随之减小㊂因此，釆用120s 作为本实验的积累时间(反应底液：含有4ˑ10-5mol /L Gefitinib 的pH 4.0的0.20M 乙酸盐缓冲液)㊂
2.5㊀线性关系
配制不同浓度的Gefitinib 溶液分别用DNA 固定化Ag -
第49卷第1期李洁，等:dsDNA 修饰Ag -Thi -nGO 电极作为生物传感器检测吉非替尼31
㊀Thionine -nGO 在几组Gefitinib 溶液中测定㊂加入反应底液，使用差分脉冲伏安法(DPV)测定响应电流，绘制了峰值电流与Gefitinib 浓度的关系曲线，如图10所示㊂在1~100μM 范围内Gefitinib 浓度与响应电流呈线性关系，线性回归方程分别为I(μA)=0.3462+0.0488C (μM)，相关系数R =0.9923，检测限为0.5μM，线性关系如图11所示㊂通过5次重复测量评估其再现性，相应的相对标准偏差为2.12%，说明本法具有良好的重现性
㊂
图10㊀不同浓度Gefitinib 的DPV 图
Fig.10㊀DPV diagram of different concentrations of
Gefitinib
图11㊀响应电流与Gefitinib 浓度线性关系图
Fig.11㊀Linear relationship between response current and
Gefitinib concentration
2.6㊀干扰试验
表1㊀Ag -Thionine -nGO 电极的抗干扰实验测定结果Table 1㊀Anti -interference test results of Ag -Thionine -nGO
electrode
其他电活性物质
RE /%抗坏血酸 3.6葡萄糖 3.1尿酸
2.8
电化学传感器对一些电活性物质(如血液中的抗坏血酸㊁葡萄糖和尿酸)的响应会影响电极的电流响应从而产生干扰，降低检测的准确性，因此，需评估所制备电极的抗干扰性㊂在浓度为0.4μM 的Gefitinib
溶液中分别加入浓度为0.4μM 的抗坏血酸溶液，浓度为0.4μM 的葡萄糖溶液和浓度为0.4μM 的尿酸溶液，再分别用DNA 包被的功能化Ag -Thionine -nGO 电极
按照以上实验方法测定，结果如表1所示，相对误差RE 均小于5%，说明电极对药物的响应具有专一性，其他电活性物质的存在对测定无明显影响，说明该电极具有很强的抗干扰能力㊂
2.7㊀实际样品及回收率的测定
取1mg Gefitinib 样品溶解于二次水中，超声分散均匀，在100mL 容量瓶中定容㊂分别取不同量的上清液用乙酸盐缓冲液(0.20M,pH 4.0)稀释㊂采用标准加入法，用差分脉冲伏安法测定响应电流，每份样品平行检测三次，结果如表2所示，回收率范围为99.5%~103.6%,RSD 范围为2.7%~3.5%，说明该传感器对Gefitinib 靶向药的测定可靠性较高㊂
表2㊀Ag -Thionine -nGO 电极对Gefitinib 靶向药的测定结果及
方法回收率(n =3)
Table 2㊀Determination of Gefitinib targeted drug by Ag -Thionine -nGO electrode and method recovery (n =3)
样品编号
加标浓度
(ˑ10-6
mol /L)回收浓度(ˑ10-6mol /L)
回收率/%RSD /%11 1.036103.6 2.722 1.98999.5
3.53
5
5.056
101.1 3.2
3㊀结㊀论
采用差分脉冲伏安法(DPV)研究在Ag -Thionine -nGO 上的双链DNA 与溶液中Gefitinib 的相互作用㊂实验表明，它们之间通过嵌入的方式相互作用㊂通过对主要实验参数的优化，从分析的角度对制备的dsDNA 包被Ag -Thionine -nGO 的性能进行了评估㊂无标记dsDNA 包被Ag -Thionine -nGO 电极具有
快速，灵敏，操作简单，成本低等优点，在抗癌药物检测分析方面具有良好的应用前景㊂
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