：WRKY transcription factor family can help improve plant stress tolerance ， which widely exist in various
plants. After TaWRKYgene was silenced by VIGS method， it was found that the proportion of succeed Bgt inoculation increased ， and the percentage of abnormal appressoria declined ， such as papilla. The results indicated that TaWRKY gene played an important role in wheat- Bgt interaction.
小麦白粉病是由布氏白粉菌( Blumeria graminis f. sp. Tritici )侵染所引起的真菌感染性病害，如遇高温多湿天气病 害流行，会使小麦严重受害，导致减产 13%- 34%[1]。因此， 科学家一方面通过抗病育种， 不断培育新的抗病小麦品种来抵御 病害，另一方面通过深入的抗病分子机理研究， 克隆抗病相关基 因、弄清抗病信号通路以及基因工程等技术手段， 以达到抗病分 子育种的目的。
转录因子可以与真核基因启动子区中的顺式作用元件互作， 激活或抑制多个下游功能基因转
录， 从而使植株获得综合改良效 果。研究表明，WRK转录因子家族几乎存在于所有植物中，它 们共同含有一段高度保守氨基酸序列 WRKYGQK[2] WRK广泛参
与植物种子萌发与休眠、开花、代谢、激素信号转导，还参与抵 御生物和非生物胁迫等反应过程。拟南芥 AtWRK Y3基因直接调
控了植物抗毒素 Camalexin 的合成 [3] ，并且调控大量抗病相关 基因的表达[4]。大豆中GmWRKY5B GmWRKY76过表达会造成 作物提早开花，表达量的区别对花形态造成不同影响 [5] 。水稻 中OsWRKY基因的过表达有助于提高作物对病原菌的抗性， 同时
可直接调控异分支酸合成酶的表达从而增加水杨酸的浓度实现 自我调节[6]。小麦(Triticum aestivum )TaWRKY9可调节作 物对渗透压、高盐、干旱和低温等胁迫的耐性 [7] 。迄今为止， 研究人员已经在大麦 [B] 、拟南芥 [9] 、大豆[10] 和水稻 [11] 等多 种植物中都鉴定到不同数量的 WRK转录因子。
病毒诱导基因沉默 ( VIGS-induced gene silencing ， VIGS) 是引起内源mRNA特异性降解、引起基因转录沉默的技术。 VIGS
试验周期短，操作简便，并且无需转化。近年来，在植物基因功 能研究中，VIGS技术作为一种简单、快速、高效的反向遗传学 技术在禾本科植物基因功能研究中发挥了重要作用 [12-13] 。
本研究以前期工作获得的 TaWRK表达载体构建基因为基础[14]，利用 VIGS技术获得沉默植株，通过对基因沉默前后白粉菌侵染情况 进行观察统计，最终确定 TaWRK基因在小麦抗白粉病过程中的 功能。
1材料和方法
1.1试验材料与试剂
抗白粉病品种 Brock ，由 Ray Johnson 博士惠赠。
小麦白粉菌 15 号生理小种，由中国农业科学院植物保护研 究所提供。
1.2沉默TaWRK的VIGS载体构建
在目的基因核苷酸序列的非保守区， 设计上、 下游特异性沉 默引物TaWRKY-VIGS-和Ta
WRKY-VIGS-,以抗病小麦Brock总 RNA合成的cDNA为模版，扩增富集沉默片段，将该片段与BSMY : 连接构建重组载体 BSMY : TaWRK，构建过程参见Li等［15］。
1.3基因沉默效率检测 通过限制性内切酶酶切线性化、体外转录后，获得病毒 RNA
组分通过摩擦接种方法接种到小麦第 2叶上，待接？NH2O（对照
1）、BSMV GFP（对照2）和BSMV TaWRKY组小麦第3叶伸展 完全，采用抖拂法对各株植株第 3 叶均匀高密度接种新鲜白粉菌 抱子，在相应时间点取叶片，利用半定量PCR方法检测这3组植 株中TaWRK基因的mRN冰平的水平变化，从而确定 TaWRK基 因沉默的效率。 1.4基因沉默后对小麦抗白粉病表型的影响
取接种 48，72 h 和 7 d 后的小麦叶片，用考马斯亮蓝染 方法染并观察统计白粉菌抱子的生长发育情况， 通过与对照白 粉菌抱子萌发、 畸形胞比例等的对比分析， 确定目标基因在抗白 粉病过程中的贡献。
2结果与分析
2.1 VIGS 沉默载体构建
根据已获得TaWRK基因序列，在基因的非保守区设计添加 了 NheI 识别序列的引物 WR KY -V-F（ AGCCGCAGCAGCAG）AA、CG WRKY-V-（ CTTGAAGCTGGGGTC）CT以含 TaWRK基因序列的重 组质粒作为模板，扩增用于构建BSMVt组载体的目的基因片段， 扩增结果如图 1所示。目的片段大小约为 250 bp 左右，随后将 回收后的目的片段进行酶切形成粘性末端， BSMX载体同样经过
酶切回收，与目的片段进行连接，通过进一步筛选、验证，挑选 阳性克隆送测验证。 2.2 VIGS技术沉默靶基因后 TaWRKY
表达水平检测
在TaWRK基因的特异性核苷酸序列区段设计引物，扩增一
个长227 bp的片段构建 TaWRK基因沉默载体 BSMY : TaWRKY 本次沉默试验共设置 4个组别，分别为H20对照组（空白对照）、 BSMV GFP对照组（阳性对照）、 BSMV PDS对照组（沉默PDS 基因）、BSMV TaWRKY式验组（沉默目的基因 TaWRK）。为了 验证
本试验所建立的沉默体系成功有效， 分别对各组摩擦接种后 约 15 d 的小麦第 3 叶进行表型观察， 结果如图 2 所示。除 BSMV: PDS对照组叶片发生明显白化现象之外，其他组叶片均呈绿， 说明该基因沉默体系构建成功。
2.3 TaWRKY基因沉默效率验证
为了进一步证实TaWRK基因是否被有效沉默，采用半定量
PCR的方法，对沉默后各组植株中 TaWRK基因的转录水平进行 了检测，结果如图 3 所示。从图中可以看出， 摩擦接种后， TaWRKY 试验组的mRNA水平明显低于H20和GFP对照组，说明小麦内源
TaWRK基因被有效沉默了。另外，在接种重组病毒 BSMV GFP
后，TaWRK基因的表达也有轻微下调，该现象可能是由于病毒 的侵染对植株造成了影响。
2.4TaWRKY基因沉默植株抗病分析
为了进一步研究TaWRK基因在小麦叶片与白粉菌的互作过 程中所起到的调控作用， 本研
究使用考马斯亮蓝染法分别对接 种48，72 h和7 d后的GFP组、TaWRK组小麦植株的第 3叶进 行固定、染、制片，在显微镜下进行镜检，观察各时间点中， 白粉菌萌发形态及生长状态，如图 4 所示。从图 4 中可以看出： 染菌48 h后，TaWRK组白粉菌抱子萌发状态优于对照组，抱子 萌发，芽管伸长，形成附着胞；染菌 72 h后，TaWRK试验组白 粉菌抱子大量萌发形成次生菌丝， 而各对照组中， 抱子萌发出现 分瓣型畸形附着胞、纤细型畸形附着胞等；染菌 7 d 后， TaWRKY 试验组白粉菌抱子大量生成串珠状分生抱子， 而各对照组中， 仅 有少量抱子萌发形成次生菌丝。
在镜检观察抱子发育结构的同时， 统计各个视野内白粉菌抱 子萌发率、畸形率、寄主抗性等参数。统计结果如图 5、图 6 所 示。由图可以得出，接种白粉菌 48 h后，白粉菌对TaWRK基因 沉默后的植株侵染成功率增加， 畸形附着胞比例下降，与GFP对
照组相比，TaWRK基因沉默组植株白粉菌抱子萌发率上升，畸 形附着胞（分瓣型附着胞、纤细型附着胞等）比例下降。
3结论与讨论
自 1994 年,shiguro 和 Nakamura[16]首次？母适恚？lpomoea batatas ）中克隆出第一个 WRK蛋白SPF1,研究人员对于植物 WRK转录因子家族开展了大量研究。越来越多的研究结果表明， WRKY蛋白在植物生长发育，抵御生物以及非生物胁迫等多种生 理生化过程中发挥重要作用 [17] 。前期工作中，笔者在小麦 Brock 中分离到一个 WRKY类转录因子基因TaWRKY并初步证实该基因 参与了小麦的白粉菌胁迫应答反应，但还不能够较确切了解 TaWRK基因与小麦抗白粉病之间的关系[12]。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议