载体构建(vectorconstruction)：载体构建是分⼦⽣物学研究常⽤的⼿段之⼀。主要包括已有载体多克隆位点（MCS）的改造和已有载体启动⼦、增强⼦、筛选标记等功能元件的改造。是为把DNA分⼦运送到受体细胞中去，必须寻⼀种能进⼊细胞、在装载了外来的DNA⽚段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因⼯程中，常⽤⼈⼯构建的质粒作为载体。载体构建即是构建含外源DNA的质粒。
特点：当给质粒插⼊⼀段外源DNA⽚段后，它依然能够进⾏⾃我复制。
2.多克隆位点
多克隆位点（multiple cloning site, MCS），指的是包含数个（最多20个）限制性酶切位点（restriction site）的⼀段很短的DNA序列。也称为多位点接头（polylinker），是基因⼯程中常⽤到的载体质粒的标准配置序列。MCS上含有多个单⼀酶切位点，是外源DNA的插⼊部位，每个限制性酶切位点通常是唯⼀的，即它们在⼀个特定的载体质粒中只出现⼀次。不同酶的酶切位点可有重叠。单⼀酶切位点就是只有⼀种特定的酶能够识别并进⾏酶切的位点，多克隆位点⼀般是位于质粒上的⼀段序列，这段序列含有很多个酶切位点，但这些酶切位点每⼀个都被⼀种酶识别并酶切。 3.质粒构建
（1）质粒构建原理
质粒构建是分⼦⽣物学研究中最常⽤的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作⽤，分别对⽬的基因和载体DNA进⾏适当切割和修饰后，将⼆者连接在⼀起，再导⼊宿主细胞，实现⽬的基因在宿主细胞内的正确表达。
（2）质粒构建⽅式
质粒构建⽅式多样，常规的T4连接酶，下⾯就介绍下T4连接酶构建质粒⽅法，T4连接酶可⽤于平末端也可⽤于粘性末端连接，但⼀般推荐适⽤黏性末端。
（3）质粒载体的制备
质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，⼀般推荐使⽤双酶切。其实⽬的就只有⼀个，尽量使载体的末端具有特异性，防⽌⾃连。 4.⼀般⽬的基因⽤于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：
（1）选择质粒上两个酶切位点的距离不应⼩于太⼩（>10bp），否则影响限制性内切酶对切点的识别，不利于空载体的双酶切。
（2）⼀般⽬的基因⽤于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：
⽬的基因⽚段内部不含有所选的酶切位点（不然鉴定阳性重组⼦双酶切时会将⽬的基因切断）。
（3）实验后继应⽤的所有载体（真核、原核、酵母、昆⾍）都尽可能含有所选的酶切位点。并且要保证在载体上的插⼊⽅向正确（定向克隆）。（不然换载体表达时，还要重新设计引物，以引进新的酶切位点）。
（4）尽可能选⽐较常⽤的酶切位点（常⽤切点酶的价格⽐较便宜）。表达载体构建
（5）两个酶切点⾄少隔上3个碱基。
（6）两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
（7）最好使⽤酶切效率⾼的酶。
（8）最好使⽤双酶切有共同buffer的酶。
注：质粒构建完成后可利⽤PCR原理进⾏测序验证。
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