一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液及单宁含量的测定方法

1.本发明涉及葡萄酒检测技术领域，具体而言，涉及一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液及单宁含量的测定方法。

背景技术：

2.涩感是干红葡萄酒重要的感官特性之一，其产生原因是葡萄酒中以单宁为主的酚类物质与口腔中唾液蛋白结合形成沉淀，从而引发口腔上皮细胞收缩、起皱。目前，干红葡萄酒涩感强度主要通过专业品评小组打分获得，但打分结果易受品评员主观因素及环境因素影响。而一些化学沉淀方法，如卵清蛋白沉淀法、牛血清蛋白沉淀法等常用于检测葡萄酒中酚类物质总量以表征葡萄酒涩感强度，但这些方法使用的蛋白试剂与真实唾液差异较大，结合单宁的能力弱，其实验结果与品评结果相关性低。
3.各方法的具体缺陷如下：
4.传统总酚检测法(如福林肖卡法)所检测的酚类物质包括单宁、花苷、酚酸等，无法特异性区分花苷和酚酸等“低涩感”的酚类物质，所得结果会高估酒样的真实涩感强度。
5.传统蛋白沉淀法(如牛血清蛋白沉淀法)采用单一蛋白溶液为实验材料，利用蛋白-单宁沉淀反应得到酒样中单宁含量，使用的蛋白种类单一，且通常为非唾液来源的球状蛋白，如牛血清蛋白。此类蛋白与黄烷醇单体和二聚体的结合能力弱，所得结果会低估酒样的真实涩感强度。
6.传统唾液沉淀指数法以人类唾液为实验材料，利用蛋白-单宁沉淀反应得到酒样中单宁含量，该方法需要在实验前收集无吸烟史的健康志愿者的静息唾液；该方法采用电泳法检测反应后的蛋白灰度，由于电泳法能够检测到的两个蛋白并不是与单宁亲和性最强的蛋白家族，因此该方法的检测结果不足以代表唾液蛋白与单宁结合的全部结果，导致检测的准确性和灵敏度较差。
7.另外，该方法需要收集真实唾液，而真实唾液中的蛋白含量易受志愿者个人因素的影响，这就导致了该方法的可重复性差，检测结果并不稳定。

技术实现要素：

8.本发明所要解决的技术问题是提供一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液及单宁含量的测定方法。
9.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
10.本发明提供一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液，所述人工唾液中包括α-淀粉酶、聚-l-脯氨酸以及人工唾液缓冲液。
11.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
12.进一步，还包括乳铁蛋白、溶菌酶、牛血清蛋白；所述乳铁蛋白的浓度为0～200mg/
l，所述溶菌酶的浓度为0～50mg/l，所述α-淀粉酶的浓度为 300～500mg/l，所述牛血清蛋白的浓度为0～250mg/l，所述聚-l-脯氨酸的浓度为100～300mg/l。
13.进一步，所述乳铁蛋白的浓度为145.7mg/l，所述溶菌酶的浓度为19.3 mg/l，所述α-淀粉酶的浓度为425.8mg/l，所述牛血清蛋白的浓度为103.2 mg/l，所述聚-l-脯氨酸的浓度为233.6mg/l。
14.进一步，所述人工唾液缓冲液的组分及各组分的浓度为，5.208g/l碳酸氢钠，1.369g/l三水合磷酸氢二钾，0.877g/l氯化钠，0.477g/l氯化钾以及0.441g/l二水合氯化钙，溶剂为水。
15.进一步，所述人工唾液的ph值为6.5～7.5。
16.本发明提供一种采用上述的人工唾液对葡萄酒中单宁含量的测定方法，包括以下步骤：
17.s1、建立单宁含量与所述人工唾液中各蛋白的蛋白损失率的线性方程；
18.s2、将所述人工唾液与待测酒样按照8:1的体积比混合，并在37℃孵育，孵育后离心并保留样品上清液；
19.s3、采用与步骤s2相同的方法将所述人工唾液与蒸馏水混合，并得到对照上清液；
20.s4、采用液相谱法分别检测所述样品上清液和所述对照上清液中的聚
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l-脯氨酸含量；采用电泳法分别检测所述样品上清液和所述对照上清液中各蛋白的含量；
21.s5、根据检测到的蛋白含量计算所述样品上清液中各蛋白的蛋白损失率，并带入所述步骤s1的线性方程中，计算得到待测酒样中的单宁含量；
22.蛋白损失率的计算公式为：蛋白损失率＝(对照上清液中蛋白含量-样品上清液中蛋白含量)/对照上清液中蛋白含量。
23.进一步，所述步骤s1中，所述线性方程的建立方法包括以下步骤：
24.s1-1、配制多个浓度梯度的单宁标准溶液；
25.s1-2、将每个浓度的单宁标准溶液分别与所述人工唾液混合并反应，计算反应后每种蛋白的蛋白损失率；
26.s1-3、对每个单宁标准溶液及其对应的各蛋白的蛋白损失率进行多元线性回归处理，得到所述线性方程。
27.进一步，所述步骤s1-1中，单宁标准溶液的浓度分别为0.2g/l、0.5g/l、 1.0g/l、2.0g/l、2.5g/l、4.0g/l和5.0g/l；
28.所述步骤s1-2中，所述人工唾液中的蛋白及其浓度为，145.7mg/l乳铁蛋白、19.3mg/l溶菌酶、425.8mg/lα-淀粉酶、103.2mg/l牛血清蛋白、233.6mg/l聚-l-脯氨酸；
29.所述步骤s1-3中得到的所述线性方程为，y
单宁
＝0.623x
乳铁蛋白
+3.3409x 溶菌酶
+3.1954x
淀粉酶
+1.2168x
牛血清蛋白
+1.0526x
聚-l-脯氨酸-0.6648；其中，x为蛋白损失率，y为待测酒样中的单宁含量，单位为g/l。
30.进一步，所述步骤s3中，所述上清液中各蛋白的蛋白损失率的具体检测方法为：
31.取一部分所述上清液，采用液相谱法检测聚-l-脯氨酸的含量，并根据检测结果计算聚-l-脯氨酸的蛋白损失率；
32.取剩余所述上清液，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测其他蛋白的含量，并根据检测结果计算其他各蛋白的蛋白损失率。
33.进一步，所述液相谱法采用的分析参数为：
34.谱柱为zorbax300sb-c18谱柱，规格为4.6
×
250mm，填料粒径为5μm；
35.流动相a相为体积分数0.2％的三氟乙酸水溶液，流动相b相为含有体积分数0.2％的三氟乙酸的甲醇和乙腈的混合溶液，其中，甲醇和乙腈的体积比为70:30；
36.检测时，所述谱柱的柱温为40℃，紫外信号设定为214nm；所述流动相b相的流速为0.4ml/min；洗脱方式为梯度洗脱。
37.进一步，所述梯度洗脱的洗脱程序为：
38.0～10min，所述流动相a相的体积百分比为90％，所述流动相b相的体积百分比为10％；
39.10～15min，所述流动相a相的体积百分比由90％下降至78％，所述流动相b相的体积百分比为由10％上升至22％；
40.15～23min，所述流动相a相的体积百分比为78％，所述流动相b相的体积百分比为22％；
41.23～25min，所述流动相a相的体积百分比由78％下降至72％，所述流动相b相的体积百分比为由22％上升至28％；
42.25～40min，所述流动相a相的体积百分比为72％，所述流动相b相的体积百分比为28％；
43.40～40.1min，所述流动相a相的体积百分比由72％下降至40％，所述流动相b相的体积百分比为由28％上升至60％；
44.40.1～50min，所述流动相a相的体积百分比由40％下降至0，所述流动相b相的体积百分比为由60％上升至100％；
45.50～60min，所述流动相a相的体积百分比为0，所述流动相b相的体积百分比为100％。
46.本发明的有益效果为：
47.(1)本发明的用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液，该人工唾液既能够模拟真实唾液离子环境，而且能够避免收集唾液中的蛋白含量易受志愿者个人因素影响的问题；
48.(2)本发明的用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液，灵敏度高、浓度稳定，在对葡萄酒中的单宁进行测定时，具有良好的稳定性和可重复性的优点；
49.(3)本发明的测定葡萄酒中单宁含量的方法，将本发明的人工唾液与待测酒样混合并反应，通过测定和计算蛋白损失率，计算得到单宁的含量；各蛋白的损失率能够充分反应蛋白与单宁的结合情况，因此，建立单宁含量与人工唾液中的各蛋白的蛋白损失率的线性方程，能够极大提高检测方法的灵敏度和准确度；
50.(4)本发明的测定葡萄酒中单宁含量的方法，采用液相谱法能够灵敏的检测聚-l-脯氨酸，由于聚-l-脯氨酸与单宁的亲和性很高，因此本方法能够具有更高的灵敏度和准确度；
51.(5)本发明的测定葡萄酒中单宁含量的方法，能准确测定葡萄酒中的单宁含量，并能够有效评价葡萄酒的涩感强度，实现了对葡萄酒的单宁含量和涩感的客观评定，并且具有高效、准确、稳定和可重复性好的方法。
附图说明
52.图1为本发明的实施例1中，真实唾液中的9个蛋白家族与单宁的亲和性对比图。
具体实施方式
53.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
54.本发明的用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液，包括α-淀粉酶、聚
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l-脯氨酸、乳铁蛋白、溶菌酶、牛血清蛋白以及人工唾液缓冲液。
55.本发明的人工唾液，不仅能够模拟真实唾液离子环境，而且其含有的各种蛋白与单宁具有良好的亲和性，尤其是聚-l-脯氨酸；这样，本发明的人工唾液具有灵敏度高、浓度稳定的优点，在对葡萄酒中的单宁进行测定时，具有良好的稳定性和可重复性。
56.优选的，本发明的人工唾液中，乳铁蛋白的浓度为0～200mg/l，溶菌酶的浓度为0～50mg/l，α-淀粉酶的浓度为300～500mg/l，牛血清蛋白的浓度为0～250mg/l，聚-l-脯氨酸的浓度为100～300mg/l；上述各蛋白的浓度范围，与真实唾液中的浓度范围相同，使本发明的人工唾液能够更好的模拟真实唾液。
57.进一步优选的，乳铁蛋白的浓度为145.7mg/l，溶菌酶的浓度为19.3 mg/l，α-淀粉酶的浓度为425.8mg/l，牛血清蛋白的浓度为103.2mg/l，聚-l-脯氨酸的浓度为233.6mg/l；经试验验证，上述各蛋白的浓度在测定单宁含量时具有最佳的效果。
58.优选的，人工唾液缓冲液的组分及各组分的浓度为，5.208g/l碳酸氢钠，1.369g/l三水合磷酸氢二钾，0.877g/l氯化钠，0.477g/l氯化钾以及0.441g/l二水合氯化钙，溶剂为水；上述人工唾液缓冲液能够良好的模拟真实唾液的环境，进一步提高对单宁含量测定的准确性和稳定性。
59.优选的，人工唾液的ph值为6.5～7.5；进一步优选的，人工唾液的ph 值为6.6。
60.本发明的葡萄酒中单宁含量的测定方法，包括以下步骤：
61.s1、建立单宁含量与所述人工唾液中各蛋白的蛋白损失率的线性方程。
62.s2、将人工唾液与待测酒样按照8:1的体积比混合，并在37℃孵育，孵育后离心并保留样品上清液。
63.s3、采用与步骤s2相同的方法将所述人工唾液与蒸馏水混合，并得到对照上清液。
64.s4、采用液相谱法分别检测样品上清液和对照上清液中的聚-l-脯氨酸含量；采用电泳法分别检测样品上清液和对照上清液中其他蛋白的含量。
65.需要说明的是，上述所谓的“含量”并非是蛋白的绝对含量。对于聚-l
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脯氨酸而言，采用液相谱的峰面积表征其含量，对于其他蛋白，采用电泳条带的灰度表征其含量。对于本发明的测定方法，由于使用的是各蛋白的损失率对单宁含量进行测定，因此，并不需要检测到各蛋白的绝对含量，可以仅采用上述方式表征其相对含量，只要能够通过对照上清和样品上清计算得到损失率即可。
66.s5、根据检测到的蛋白含量计算所述样品上清液中各蛋白的蛋白损失率，并带入步骤s1的线性方程中，计算得到待测酒样中的单宁含量。
67.蛋白损失率的计算公式为：蛋白损失率＝(对照上清液中蛋白含量-样品上清液中蛋白含量)/对照上清液中蛋白含量。
68.本发明的测定方法，采用人工唾液与待测酒样混合，并检测和计算各蛋白的蛋白损失率，计算单宁含量；各蛋白的损失率能够充分反应蛋白与单宁的结合情况，将蛋白损失率与单宁含量建立线性关系，能够极大提高检测方法的灵敏度和准确度。
69.同时，本发明采用液相谱的方法单独对聚-l-脯氨酸的含量进行检测，也能够有效提高本方法检测的准确性和灵敏性。这是因为，聚-l-脯氨酸与单宁的亲和性很高，但是其分子量过小，仅为1000-10000da，常规的电泳无法检测。
70.优选的，步骤s1中，线性方程的建立方法包括以下步骤：
71.s1-1、配制多个浓度梯度的单宁标准溶液；
72.s1-2、将每个浓度的单宁标准溶液分别与所述人工唾液混合并反应，计算反应后每种蛋白的蛋白损失率；
73.s1-3、对每个单宁标准溶液及其对应的各蛋白的蛋白损失率进行多元线性回归处理，得到线性方程。
74.通过上述步骤得到的线性方程能够准确的计算出待测样品中的单宁含量。
75.需要说明的是，在实际使用中，随着人工唾液中的具体蛋白种类和浓度的变化，上述线性方程也是变化的。在确定使用的具体人工唾液的成分后，每次进行检测时需要重新计算具体的线性方程。
76.通过实验发现，在各种人工唾液中，以下人工唾液及依据其建立的线性方程测定的单宁含量最为准确：
77.s1-1中，单宁标准溶液的浓度分别为0.2g/l、0.5g/l、1.0g/l、2.0g/l、 2.5g/l、4.0g/l和5.0g/l；
78.s1-2中，人工唾液中的蛋白及其浓度为，145.7mg/l乳铁蛋白、19.3mg/l 溶菌酶、425.8mg/lα-淀粉酶、103.2mg/l牛血清蛋白、233.6mg/l聚-l
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脯氨酸；
79.步骤s1-3中得到的线性方程为，y
单宁
＝0.623x
乳铁蛋白
+3.3409x
溶菌酶 +3.1954x
淀粉酶
+1.2168x
牛血清蛋白
+1.0526x
聚-l-脯氨酸-0.6648；其中，x为蛋白损失率，y为待测酒样中的单宁含量，单位为g/l。
80.优选的，样品上清液中各蛋白的蛋白损失率的具体检测和计算方法为：
81.分别取80μl样品上清液和对照上清液，采用安捷伦1100系列液相谱仪检测两者的聚-l-脯氨酸的含量。使用安捷伦openlab2.5分析软件计算相对于对照上清液而言，样品上清液中的聚-l-脯氨酸的蛋白损失率。
82.液相谱法采用的分析参数为：
83.谱柱为zorbax300sb-c18谱柱(agilenttechnologiesinc.,usa)，规格为4.6
×
250mm，填料粒径为5μm；
84.流动相a相为体积分数0.2％的三氟乙酸水溶液，流动相b相为含有体积分数0.2％的三氟乙酸的甲醇和乙腈的混合溶液，其中，甲醇和乙腈的体积比为70:30；
85.检测时，谱柱的柱温为40℃，紫外信号设定为214nm；流动相b相的流速为0.4ml/min；洗脱方式为梯度洗脱，洗脱程序如表1所示。
86.表1液相梯度洗脱时间表
[0087][0088]
另取30μl上清液，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测乳铁蛋白、牛血清蛋白、α-淀粉酶和溶菌酶的蛋白条带，其中，90kda蛋白条带为乳铁蛋白， 59kda蛋白条带为淀粉酶，66kda蛋白条带为白蛋白，14kda蛋白条带为溶菌酶。得到各蛋白条带后，使用imagej1.53a分析软件计算相对于对照上清液而言，样品上清液中的上述各蛋白条带密度损失率，即可得到乳铁蛋白、牛血清蛋白、α-淀粉酶和溶菌酶的蛋白损失率。
[0089]
本发明的人工唾液以及单宁测定方法，能够有效测定葡萄酒中的单宁含量。在测定时，该方法具有良好的可重复性和稳定性，不仅灵敏度高，而且能够客观反映葡萄酒中的单宁含量，为进一步评价葡萄酒的涩感、感官风味、酒体结构等需求提供了良好的测定手段。
[0090]
以下通过具体的实施例对本发明的效果进行举例说明。
[0091]
实施例1人工唾液中蛋白种类的筛选
[0092]
本实施例为反映人的口腔中蛋白与单宁的全部反应信息，采用真实唾液和5款不同的干红葡萄酒为实验材料，通过将真实唾液与各干红葡萄酒混合并反应，再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析参与涩感形成且与单宁亲和性高的蛋白家族种类，实验结果如图1所示。
[0093]
本实施例的真实唾液来自于志愿者自愿提供，5款干红葡萄酒 (sample1～5)分别为2019年新疆干红葡萄酒，品种依次为赤霞珠，赤霞珠，赤霞珠，马瑟兰，赤霞珠。
[0094]
通过图1可以看出，在真实的唾液中，唾液蛋白与单宁的亲和性排序为：脯氨酸家族(prps)》淀粉酶(α-amylase)》溶菌酶/胱抑素 (lysozyme/cystatins)》乳铁蛋白(lactoferrin)》白蛋白(albumin)》p-b 肽/富酪蛋白(p-bpeptide/statherin)》粘蛋白(mucin)。其中粘蛋白、胱抑素和富酪蛋白在唾液中易形成蛋白胶束，在真实唾液预处理过程中或已损失而不能参与蛋白沉淀反应。
[0095]
因此，脯氨酸家族、淀粉酶、乳铁蛋白、溶菌酶、白蛋白和p-b肽被挑选为模拟唾液的组成蛋白。其中p-b肽与脯氨酸家族均含有丰富的脯氨酸，可使用聚-l-脯氨酸替代；其他蛋白可直接购买获得。
[0096]
实施例2人工唾液中蛋白浓度的确定
[0097]
依据已报道的人类唾液蛋白浓度，挑选的5种蛋白浓度范围分别是： 0～200mg/l乳铁蛋白，0～50mg/l溶菌酶，300～500mg/lα-淀粉酶，0～250 mg/l牛血清蛋白，100～300mg/l聚-l-脯氨酸；人工唾液ph范围是6.5～7.5。基于上述蛋白浓度和ph设计响应面优化实验，获得最佳人工唾液组成，响应面优化结果如表2所示。
[0098]
表2响应面优化四次模型的方差分析
[0099][0100][0101]
通过表2的优化结果可以得出，模型的决定系数r2＝0.9987，调整后的决定系数r2(adjusted)＝0.9946(p《0.05)，表明模型可接受。模型f值为246.22说明此模型是显着的。失拟项(lackoffit)(p》0.05)不显着，表明此模型适合优化因子和预测因子y。优化因子分别为乳铁蛋白(x1)、溶菌酶(x2)、α-淀粉酶(x3)、牛血清白蛋白(x4)和聚-l-脯氨酸(x5)的浓度和ph(x6)。
[0102]
经过计算，上述各蛋白的最佳浓度为，145.7mg/l乳铁蛋白，19.3mg/l 溶菌酶，425.8mg/lα-淀粉酶，103.2mg/l牛血清蛋白，233.6mg/l聚
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l-脯氨酸，并且ph为6.6。
[0103]
实施例3人工唾液检测效果的验证
[0104]
本实施例根据实施例2得到的各蛋白的最佳浓度配制人工唾液，并采用该人工唾液对60款市售待测酒样中的单宁含量分别进行检测。采用人工唾液进行检测方法记为aspi法。
[0105]
本实施例配制的人工唾液具体成分包括人工唾液缓冲液和5种蛋白，其中，人工唾液缓冲液的成分为水、5.208g/l碳酸氢钠，1.369g/l三水合磷酸氢二钾，0.877g/l氯化钠，0.477g/l氯化钾，0.441g/l二水合氯化钙。将上述成分混合并将ph调至6.6。5种蛋白的浓度分别为145.7mg/l 乳铁蛋白，19.3mg/l溶菌酶，425.8mg/lα-淀粉酶，103.2mg/l牛血清蛋白，233.6mg/l聚-l-脯氨酸。
[0106]
本实施例采用上述人工唾液进行单宁检测的具体步骤为：
[0107]
1、取200μl人工唾液与25μl酒样均匀混合，在37℃孵育5分钟；孵育后10000r/min离心2分钟，得到样品上清液；取200μl人工唾液与25μl蒸馏水均匀混合，在37℃孵育5分钟；孵育后10000r/min离心2 分钟，得到对照上清液；
[0108]
2、分别取30μl样品上清液和对照上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测，并使用imagej1.53a分析软件计算乳铁蛋白、牛血清蛋白、α-淀粉酶和溶菌酶的蛋白损失率。
[0109]
3、分别取80μl样品上清液和对照上清液进行液相谱检测，检测使用的谱仪为安捷伦1100系列。检测后使用安捷伦openlab2.5分析软件计算聚-l-脯氨酸的蛋白损失率。
[0110]
4、液相谱参数：谱柱为zorbax300sb-c18柱(4.6
×
250mm，5 μm)(agilenttechnologiesinc.,usa)；流动相a为0.2％的三氟乙酸水溶液，流动相b由甲醇/乙腈(70/30，v/v)和0.2％的三氟乙酸组成；流速为0.4ml/min，柱温设定为40℃，紫外信号设定为214nm；梯度洗脱程序如前述的表1所示。
[0111]
5、建立用于测定单宁含量的线性方程：
[0112]
配制单宁梯度溶液(0.2、0.5、1.0、2.0、2.5、4.0和5.0g/l)。对单宁溶液与人工唾液反应后的5种蛋白损失率进行多元线性回归处理，得到公式：
[0113]y单宁
＝0.623x
乳铁蛋白
+3.3409x
溶菌酶
+3.1954x
淀粉酶
+1.2168x
牛血清蛋白
+1.0526x
聚-l-脯氨酸-0.6648。
[0114]
其中x为蛋白损失率，y为酒样中单宁含量(g/l)。
[0115]
另外，分别采用福林肖卡法(fc)、福林单宁法(fd)、甲基纤维素沉淀法(mcp)、牛血清蛋白沉淀法(bsa)、传统唾液蛋白沉淀指数法(spi)对相同的酒样进行检测。将上述各方法的检测结果与本实施例的检测结果分别与感官品评打分结果的相关性以及拟合优度(r2)，实验结果如下：
[0116]
表3化学法检测结果与感官品评结果间的相关性
[0117]
[0118][0119]
由表3可知，本实施例的aspi法测得酒样中单宁含量与真实打分的相关性最高(coef＝0.94)，所得拟合曲线的r2也是几种方法中最高的，说明此方法对涩感强度评价的准确性最好。综上，本发明提出的一种基于人工唾液系统的化学沉淀法能够稳定准确地评价干红葡萄酒的涩感强度。
[0120]
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0121]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液中包括α-淀粉酶、聚-l-脯氨酸以及人工唾液缓冲液。2.根据权利要求1所述一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液，其特征在于，还包括乳铁蛋白、溶菌酶、牛血清蛋白；所述乳铁蛋白的浓度为0～200mg/l，所述溶菌酶的浓度为0～50mg/l，所述α-淀粉酶的浓度为300～500mg/l，所述牛血清蛋白的浓度为0～250mg/l，所述聚-l-脯氨酸的浓度为100～300mg/l。3.根据权利要求2所述一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液，其特征在于，所述乳铁蛋白的浓度为145.7mg/l，所述溶菌酶的浓度为19.3mg/l，所述α-淀粉酶的浓度为425.8mg/l，所述牛血清蛋白的浓度为103.2mg/l，所述聚-l-脯氨酸的浓度为233.6mg/l。4.根据权利要求1～3任意一项所述一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液缓冲液的组分及各组分的浓度为，5.208g/l碳酸氢钠，1.369g/l三水合磷酸氢二钾，0.877g/l氯化钠，0.477g/l氯化钾以及0.441g/l二水合氯化钙，溶剂为水。5.根据权利要求1～3任意一项所述一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液的ph值为6.5～7.5。6.一种采用权利要求1～5任意一项所述的人工唾液对葡萄酒中单宁含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、建立单宁含量与所述人工唾液中各蛋白的蛋白损失率的线性方程；s2、将所述人工唾液与待测酒样按照8:1的体积比混合，并在37℃孵育，孵育后离心并保留样品上清液；s3、采用与步骤s2相同的方法将所述人工唾液与蒸馏水混合，并得到对照上清液；s4、采用液相谱法分别检测所述样品上清液和所述对照上清液中的聚-l-脯氨酸的含量；采用电泳法分别检测所述样品上清液和所述对照上清液中各蛋白的含量；s5、根据检测到的蛋白含量计算所述样品上清液中各蛋白的蛋白损失率，并带入所述步骤s1的线性方程中，计算得到待测酒样中的单宁含量；蛋白损失率的计算公式为：蛋白损失率＝(对照上清液中蛋白含量-样品上清液中蛋白含量)/对照上清液中蛋白含量。7.根据权利要求6所述一种葡萄酒中单宁含量的测定方法，其特征在于，所述步骤s1中，所述线性方程的建立方法包括以下步骤：s1-1、配制多个浓度梯度的单宁标准溶液；s1-2、将每个浓度的单宁标准溶液分别与所述人工唾液混合并反应，计算反应后每种蛋白的蛋白损失率；s1-3、对每个单宁标准溶液及其对应的各蛋白的蛋白损失率进行多元线性回归处理，得到所述线性方程。8.根据权利要求7所述一种葡萄酒中单宁含量的测定方法，其特征在于，所述步骤s1-1中，单宁标准溶液的浓度分别为0.2g/l、0.5g/l、1.0g/l、2.0g/l、2.5g/l、4.0g/l和5.0g/l；所述步骤s1-2中，所述人工唾液中的蛋白及其浓度为，145.7mg/l乳铁蛋白、19.3mg/l溶菌酶、425.8mg/lα-淀粉酶、103.2mg/l牛血清蛋白、233.6mg/l聚-l-脯氨酸；
所述步骤s1-3中得到的所述线性方程为，y
单宁
＝0.623x
乳铁蛋白
+3.3409x
溶菌酶
+3.1954x
淀粉酶
+1.2168x
牛血清蛋白
+1.0526x
聚-l-脯氨酸-0.6648；其中，x为蛋白损失率，y为待测酒样中的单宁含量，单位为g/l。9.根据权利要求6所述一种葡萄酒中单宁含量的测定方法，其特征在于，所述步骤s4中，所述液相谱法采用的分析参数为：谱柱为zorbax 300sb-c18谱柱，规格为4.6
×
250mm，填料粒径为5μm；流动相a相为体积分数0.2％的三氟乙酸水溶液，流动相b相为含有体积分数0.2％的三氟乙酸的甲醇和乙腈的混合溶液，其中，甲醇和乙腈的体积比为70:30；检测时，所述谱柱的柱温为40℃，紫外信号设定为214nm；所述流动相b相的流速为0.4ml/min；洗脱方式为梯度洗脱。10.根据权利要求9所述一种葡萄酒中单宁含量的测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱的洗脱程序为：0～10min，所述流动相a相的体积百分比为90％，所述流动相b相的体积百分比为10％；10～15min，所述流动相a相的体积百分比由90％下降至78％，所述流动相b相的体积百分比为由10％上升至22％；15～23min，所述流动相a相的体积百分比为78％，所述流动相b相的体积百分比为22％；23～25min，所述流动相a相的体积百分比由78％下降至72％，所述流动相b相的体积百分比为由22％上升至28％；25～40min，所述流动相a相的体积百分比为72％，所述流动相b相的体积百分比为28％；40～40.1min，所述流动相a相的体积百分比由72％下降至40％，所述流动相b相的体积百分比为由28％上升至60％；40.1～50min，所述流动相a相的体积百分比由40％下降至0，所述流动相b相的体积百分比为由60％上升至100％；50～60min，所述流动相a相的体积百分比为0，所述流动相b相的体积百分比为100％。

技术总结

本发明涉及葡萄酒检测技术领域，具体而言，涉及一种用于测定葡萄酒中单宁含量的人工唾液及单宁含量的测定方法。该人工唾液中包括α-淀粉酶、聚-L-脯氨酸、乳铁蛋白、溶菌酶、牛血清蛋白以及人工唾液缓冲液；能够模拟真实唾液离子环境，灵敏度高、浓度稳定，在对葡萄酒中的单宁进行测定时，具有良好的稳定性和可重复性。本发明的方法建立单宁含量与人工唾液中的各蛋白的蛋白损失率的线性方程，并采用液相谱法单独检测聚-L-脯氨酸，使本方法灵敏度高、准确度好、可重复性好。可重复性好。可重复性好。