用于结核病诊断的标志物及应用

1.本技术属于分子生物医学技术领域，具体涉及一种用于结核病诊断的标志物及应用。

背景技术：

2.结核病(tuberculosis，tb)是一个全球性的公共卫生问题，主要由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,mtb)感染引起。目前，尽管已经进行了有效的疫苗接种以及药物，但医学上tb仍然是难以攻克的疾病。目前tb的防治存在不少困境，主要是由于结核病的诊断工具存在特异性差、耗时长、灵敏度不高的缺点，并且难以区分活动性结核感染(active tuberculosis，atb)及潜伏性结核感染(latent tuberculosis，ltbi)，这使得高危人无法被筛查出来，健康人暴露感染的风险随之增高。紧随其后的还有耐多药结核(multiple drug-resistant tuberculosis，mdr-tb)、广泛耐药结核(extensively drug-resistanttuberculosis，xdr-tb)带来的抗tb难度的增加。再者就是由于mtb可以在宿主体内保持休眠状态，这些休眠的mtb除了存在再激活的风险，还存在通过调节宿主的免疫细胞影响疾病进程的风险。因此，为了实现到2035年消灭结核病的目标，当前的结核病防控除了要求急切地需要更好的认识结核病的免疫机制与免疫微环境之外，还迫切地需要获得更好的工具来诊断、和预防tb。
3.tb实质上是一种由气溶胶引起的疾病，当mtb进入下呼吸道后，mtb可以感染巨噬细胞、中性粒细胞及树突状细胞等免疫细胞，被感染的细胞引发局部炎症反应，如炎症信号传导、细胞因子释放等，同时mtb感染诱导巨噬细胞向抗炎反应方向极化。局部炎症反应将吸引大量免疫细胞到感染部位，巨噬细胞大量聚集，这种由巨噬细胞及其衍生的局部区域浸润所形成的边缘清晰的病灶，就是结核病的病理标志——结核性肉芽肿(tuberculous granuloma，tg)。tg组织的主要作用是将免疫反应集中在局部有限区域来达到控制结核分枝杆菌感染的目的。tg是许多慢性间质性病的特征表现，是抗炎反应的核心区域，但同时也为mtb提供了天然的休眠场所。虽然推测mtb可能会被扼杀在肉芽肿组织内，但mtb不会完全被根除，因为mtb的免疫逃逸策略使它能在肉芽肿内持续存在，在某些情况下mtb能被重新激活。因此，肉芽肿组织的存在是宿主免疫反应和持续存在的mtb之间动态作用的结果，含有mtb的肉芽肿组织代表了一个独特的战场，其中复杂的免疫微环境可能会反作用于宿主的免疫。所以，全面了解tg的免疫环境对tb的诊断、都功在千古、利在千秋。
4.多胺是一类于各种细胞中屡见不鲜、具有生物活性的低分子化合物，主要包括亚精胺(spermidine，spd)和精胺(spermine，spm)等，已被报道与多种免疫调节功能及疾病相关，在机体内发挥着举足轻重的生理作用。
5.精胺氧化酶(spermine oxidase，smox)是近年来发现的多胺代谢中一个较为关键的蛋白酶，在维持多胺的平衡中发挥重要作用。在响应肿瘤反应时，smox的表达水平会出现上调，高度表达的smox可能会增加患癌的风险。细胞内smox表达水平的升高可能会促进内质网应激反应并进一步导致组织损伤。并且，smox能调节巨噬细胞的生物学功能，spd可通
过smox介导的免疫反应上调巨噬细胞杀死病原体的效应。而巨噬细胞不仅是mtb感染期间的主要宿主细胞，还是结核性肉芽肿的重要组成细胞。
6.然而，目前较少有研究将多胺与结核病联系起来，由此可见，了解多胺在结核病发生发展中的意义有一定的科学作用。

技术实现要素：

7.鉴于现有技术存在的缺点，本技术提供了一种用于结核病诊断的标志物及应用，以解决现有技术存在问题，具体采用如下的技术方案：
8.为实现上述目的及其相关的其他目的，本技术提供一种用于结核病诊断的标志物，该标志物为ag85b
+
smox
+
细胞、ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞和cd68
+
smox
+
细胞中的一种。
9.本技术还提供一种检测前述的标志物的物质在制备结核病诊断产品中的应用。
10.进一步地，检测用于结核病诊断的标志物的物质用于检测肉芽肿区域的ag85b
+
smox
+
细胞、ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞和cd68
+
smox
+
细胞的分布情况。
11.进一步地，分布情况包括ag85b
+
smox
+
细胞、ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞和cd68
+
smox
+
细胞的阳性表达率和/或密度。
12.进一步地，检测用于结核病诊断的标志物的物质用于检测结核肉芽肿的apz区域的ag85b
+
smox
+
细胞、ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞和cd68
+
smox
+
细胞的阳性表达率和/或密度大于预设值时判定为结核病。
13.进一步地，检测用于结核病诊断的标志物的物质选自抗体或芯片。
14.进一步地，所述物质用于检测取自受试者的样品。
15.进一步地，所述样品选自外周血、血浆或血清。
16.进一步地，结核病包括、肾结核、肠结核、骨结核、胃结核和肝结核。
17.本技术的有益效果是：
18.本技术创造性地将多胺代谢酶smox纳入tg组织的研究中，结果发现，多胺代谢酶smox在结核肉芽肿中特异性表达，并且参与到结核肉芽肿的形成过程中，其主要被募集到结核肉芽肿的apz区域。肉芽肿区域的ag85b
+
smox
+
细胞、ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞和cd68
+
smox
+
细胞的水平在tg组织apz区域出现表达上调的现象，该现象使得ag85b
+
smox
+
细胞、ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞和cd68
+
smox
+
细胞可以作为结核病患者的诊断指标，并且应用到相关诊断产品的制备中，具有较好的应用前景。
附图说明
19.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1是本技术的肉芽肿组织免疫荧光共聚焦结果的示意图；
21.图2是本技术的tg组织分区的示意图；
22.图3是本技术的肺肉芽肿组织细胞阳性表达及密度的示意图；
23.图4是本技术的不同区域组织smox
+
、cd68
+
、ag85b
+
的阳性表达率比较的示意图；
24.图5是本技术的不同区域组织smox
+
、cd68
+
、ag85b
+
的细胞密度的示意图；
25.图6是本技术的不同肉芽肿组织免疫荧光共定位分析的示意图；
26.图7是本技术的肺肉芽肿组织共定位细胞阳性表达及密度的示意图；
27.图8是本技术的不同区域组织ag85b
+
smox
+
、cd68
+
smox
+
、ag85b
+
cd68
+
smox
+
的阳性表达率比较的示意图；
28.图9是本技术的不同区域组织ag85b
+
smox
+
、cd68
+
smox
+
、ag85b
+
cd68
+
smox
+
的细胞密度比较的示意图。
具体实施方式
29.下面详细描述本技术的实施例，实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。
30.可以理解的是，本技术未详细说明的试剂仪器均可从市面购买获得，未详细说明的操作方法均按本领域常规操作或厂商说明书进行。
31.在本技术中，收集东莞滨海湾中心医院病理科确诊的肉芽肿组织石蜡标本4例。其中，男2例，女2例，年龄21～66岁。其中肺部肉芽肿1例，颈部肉芽肿1例，肠肉芽肿1例及腰部肉芽肿1例。所选4例tg组织标本的样本信息及其患者的基本临床信息见表1。
32.表1所选tg组织标本基本临床信息
[0033][0034][0035]
具体实验过程如下。首先将收集到的肉芽肿组织放入4％的甲醛中固定24h，固定好后流水冲洗甲醛。接着将组织放入50％、70％、85％、95％、100％的乙醇中进行梯度脱水并于二甲苯中使其透明化，透明化的组织待包埋。待石蜡融化后，将组织浸蜡处理，此步重复三遍。最后将组织放入盛有石蜡的模具中，进行包埋、冷却。将包埋好的石蜡切片于切片机中切成4μm的切片，展开后黏附于黏附载玻片上，60℃烤干。
[0036]
收集结核病患者的痰液样本作为待检标本，玻片夹持待检标本，滴加石炭酸复红2～3滴，在火焰上方加热3-5min，沸腾前立即离开，冷却后冲洗；然后使用3％盐酸酒精脱30秒左右，流水冲干；最后使用碱性美兰溶液复染1min，冲干，待玻片干燥后镜检。
[0037]
对多胺调节过程中的精胺氧化酶smox、巨噬细胞的标记物cd68、结核分枝杆菌特异性抗原85b(antigen 85b，ag85b)进行免疫荧光标记，染中抗体、浓度、孵育时间及染料详见表2。
[0038]
表2荧光染方案
[0039][0040]
将准备好的石蜡切片过二甲苯浸泡处理，每次10分钟，重复该步骤三次以保证结果的准确性。然后于100％、95％、70％梯度浓度的乙醇中进行脱蜡处理。为了保证实验的严谨性，将玻片于无菌水中洗片共3分钟后，在中性福尔马林浸泡，并重复无菌水操作。为了提高抗原的渗透性，将组织切片在1
×
抗原修复液中微波煮沸，并小火维持15分钟以回收抗原，冷却至室温后进行封闭。
[0041]
将玻片放于封闭溶液中室温震荡10分钟进行非特异性封闭。去除封闭液后，将组织切片在4℃下同稀释的一抗孵育1小时，洗片3次。接着进行二次孵育，滴加hrp室温孵育10分钟，洗片。往玻片上滴加1
×
染料工作液(1:100)100μl，浸没样本区域，室温孵育。用1
×
tbst缓冲溶液洗片3次，每次三分钟。再次进行微波抗原修复以保证信号的回收，室温下自然冷却后，灭菌水洗片1次，1
×
tbst缓冲溶液浸泡玻片。在进行完全部抗体的染之后，最后用dapi封固剂处理组织切片，指甲油封片，并通过共聚焦显微镜对组织切片进行多重免疫荧光共聚焦检测。
[0042]
组织划分及细胞计数采用inform软件完成；共聚焦图片采用olympus olyvia软件用于图像的光谱分离，对标记进行基于颜的识别。对于插图，将一系列图像中导入photoshop cc及adobe illustrator cc。graphpad 8.0软件进行统计学分析，除特殊说明外均以p《0.05为有统计学意义。
[0043]
首先，使用smox标记参与多胺代谢相关的细胞、cd68标记巨噬细胞、ag85b标记结核分枝杆菌特异性表达蛋白，采用免疫荧光染分析4例tg组织的病理形态，以判断上述抗体是否在tg组织中具有特异性信号。结果发现，smox、cd68及ag85b在tg样本均上可见特异信号，见图1。其中，dapi表示细胞核。并且，可以看出ag85b被包裹在结核肉芽肿的中心，cd68主要分布在结核肉芽肿边缘，而smox主要分布在结核肉芽肿的周围，见图1(a～d)。
[0044]
为了更好地评估tg的结构，本技术基于ag85b的荧光染结果，进一步使用inform软件通过勾选、训练、确认的步骤，构建算法以将收集到的tg组织进行分区。最终将tg组织分为ag85b阴性区域(ag85b negative zone，anz)和ag85b阳性区域(ag85b positive zone，apz)。其中anz表示肉芽肿外部区域，apz表示肉芽肿区域，见图2(a～d)。
[0045]
由于tg周围存在多种细胞的浸润，是一个高细胞密度的区域。所以，本技术接下来检测了tg的不同分区中荧光标记蛋白ag85b、cd684和smox的阳性表达率与细胞密度，以解释这些细胞在tg中的潜在作用，见图3。结果表明，smox(t＝4.325，p《0.01)、ag85b(t＝4.356，p《0.01)在apz区域的阳性表达率均高于其在anz区域的阳性表达率，cd68(t＝2.032，p》0.05)在apz区域的阳性表达率与其在anz区域的阳性表达率均无显著差异，见图4(a～c)，其中，*表示p《0.0，**表示：p《0.01，以下不再赘述。smox(t＝5.78，p《0.01)、cd68(p《0.01，t＝3.028)、ag85b(t＝5.566，p《0.01)在apz区域的细胞密度均高于其在anz区域的细胞密度，见图5(a～c)。
[0046]
本技术接下来对多胺调节过程中的蛋白smox与巨噬细胞的标记物cd68、结核分枝杆菌特异性表达蛋白ag85b在不同肉芽肿组织内进行共定位。共定位的结果显示，smox与cd68
+
的巨噬细胞、结核分枝杆菌特异性抗原ag85b
+
的细胞均存在共定位，即结核肉芽肿内存在cd68
+
smox+、ag85b
+
smox
+
以及ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞，见图6。这些共定位的结果证实，smox的表达与巨噬细胞刺激以及结核分枝杆菌刺激相关，同时smox存在于含分枝杆菌的巨噬细胞中。
[0047]
本技术进一步分析anz区域和apz区域中cd68
+
smox
+
、ag85b
+
smox
+
、ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞的阳性表达率及细胞密度，见图7，以解释这些细胞在tg形成及限制mtb传播中的潜在作用。结果表明，ag85b
+
smox
+
(t＝3.886，p《0.01)、cd68
+
smox
+
(t＝3.122，p《0.05)、ag85b
+
cd68
+
smox
+
(t＝3.42，p《0.05)细胞在apz区域的阳性表达率均高于其在anz区域的阳性表达率，见图8(a～c)。与此同时，ag85b
+
smox
+
(t＝5.066，p《0.01)、cd68
+
smox
+
(t＝3.197，p《0.05)、ag85b
+
cd68
+
smox
+
(t＝3.809，p《0.01)细胞在apz区域的细胞密度均高于其在anz区域的细胞密度，见图9(a～c)。以上结果证实，tb病灶中存在ag85b
+
smox
+
、cd68
+
smox
+
、ag85b
+
cd68
+
smox
+
共定位细胞的积累，并且这些细胞仍然是主要聚集、高度表达于肉芽肿组织的apz区域。
[0048]
综上，本技术对巨噬细胞的标记物cd68、结核分枝杆菌特异性表达蛋白ag85b以及smox在不同tg内进行共定位染分析。结果显示，在不同的tg组织中，smox与cd68存在共定位，smox在tg中的作用与巨噬细胞有关。与此同时，smox与ag85b也存在共定位，这说明smox在tg中的作用还与mtb的刺激相关。并且smox、cd68及ag85b三者也存在共定位，表明smox存在于含结核分枝杆菌的巨噬细胞中。通过检测了tg组织不同分区中cd68
+
smox
+
、ag85b
+
smox
+
、ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞的阳性表达率及细胞密度，发现这些细胞仍然是主要聚集、高度表达于肉芽肿组织的apz区域，这些cd68
+
smox
+
、ag85b
+
smox
+
、ag85b
+
cd68
+
smox
+
的细胞在促进tg形成以及限制mtb的扩散上有重要意义，从而达到影响结核病发生发展的目的。并且cd68
+
smox
+
、ag85b
+
smox
+
、ag85b
+
cd68
+
smox
+
的这种在tg组织apz区域表达上调的现象，证实着其可以作为新的tb抗原诊断标志物。基于上述研究结果，本技术还提供：一种检测ag85b
+
smox
+
细胞、ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞和cd68
+
smox
+
细胞的物质在制备结核病诊断产品中的应用。检测用于结核病诊断的标志物的物质用于检测肉芽肿区域的ag85b
+
smox
+
细胞、ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞和cd68
+
smox
+
细胞的阳性表达率和密度大于预设值时判定为结核病。此处，该预设值可以根据实际需求进行设定。根据本领域常识，检测用于结核病诊断的标志物的物质选自抗体和芯片。前述的结核病包括、肾结核、肠结核、骨结核、胃结核和肝结核。
[0049]
以上显示和描述了本技术的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本技术，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本技术的保护范围内。

技术特征：

1.一种用于结核病诊断的标志物，其特征在于，所述标志物为ag85b
+
smox
+
细胞、ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞和cd68
+
smox
+
细胞中的一种。2.一种检测权利要求1所述的标志物的物质在制备结核病诊断产品中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述物质用于检测肉芽肿区域的ag85b
+
smox
+
细胞、ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞和cd68
+
smox
+
细胞的分布情况。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述分布情况包括ag85b
+
smox
+
细胞、ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞和cd68
+
smox
+
细胞的阳性表达率和/或密度。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述物质用于检测结核肉芽肿的apz区域的ag85b
+
smox
+
细胞、ag85b
+
cd68
+
smox
+
细胞和cd68
+
smox
+
细胞的阳性表达率和/或密度大于预设值时判定为结核病。6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测用于结核病诊断的标志物的物质选自抗体或芯片。7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述物质用于检测取自受试者的样品。8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述样品选自外周血、血浆或血清。9.根据权利要求2-8任一所述的应用，其特征在于：所述结核病包括、肾结核、肠结核、骨结核、胃结核和肝结核。

技术总结

本申请公开了AG85B

技术研发人员：

王雪枝 曾今诚 张锡林 陈世浩 叶子瑜 林碧华 黄明元 崔小颖

受保护的技术使用者：

广东医科大学

技术研发日：

2022.08.24

技术公布日：

2022/12/16