”
“会读质粒图谱才能⽤好质粒。”
前⾯各个部分分别介绍了质粒的分类，复制起点，启动⼦，抗性以及蛋⽩纯化和鉴定标签，这部分将介绍蛋⽩标签的另⼀个常⽤应⽤----荧光蛋⽩标签和荧光素酶报告基因，也是质粒图谱简单介绍的最后⼀部分，后⾯将尽多尽可能简单的介绍常⽤质粒及图谱。 荧光蛋⽩有着丰富的应⽤可以观测细胞⽣命活动如肿瘤细胞的成长、⼊侵、转移和新⽣等，可以⽤于表达蛋⽩的标记，可以⽤于⽣物体中标记。 荧光素酶报告基因系统以荧光素(luciferin)为底物来检测萤⽕⾍荧光素酶(fireflyluciferase)活性的⼀种报告系统，通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的⽣物荧光。荧光素和荧光素酶这⼀⽣物发光体系，可以极其灵敏、⾼效地检测基因的表达。
01
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荧光蛋⽩
⾊荧光蛋⽩(GFP)
绿⾊荧光蛋⽩(GFP)
绿⾊荧光蛋⽩(Green fluorescent protein，简称GFP)，是⼀个由约238个氨基酸组成的蛋⽩质，蛋⽩分⼦量为27KDa，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿⾊萤光。这种蛋⽩质最早是由下村修等⼈在1962年在维多利亚多管发光⽔母中发现，发光的过程中还需要冷光蛋⽩质⽔母素的帮助，且这个冷光蛋⽩质与钙离⼦可产⽣交互作⽤。2008年10⽉8⽇，⽇本科学家下村修、美国科学家马丁·查尔菲和钱永健因为发现和改造绿⾊荧光蛋⽩⽽获得了当年的诺贝尔化学奖。
增强型绿⾊荧光蛋⽩(EGFP)
⾊荧光蛋⽩(EGFP)
增强型绿
EGFP：Enhanced Green Fluorescent Protein 即增强绿⾊荧光蛋⽩，EGFP是GFP突变系。应⽤较多的是 GFP的突变体：增强型绿⾊荧光蛋 ⽩(EGFP )，发射出的荧光强度⽐GFP⼤ 6 倍以上，因此，⽐
GFP更适合作为 ⼀种报告基因来研究基因表达、 调控、 细胞分化及蛋⽩质在⽣物体内定位和转运等。
激发光波长为488nm，发射波长为507nm，载体中构建Kozak序列使得EGFP的融合蛋⽩在真核系统中表达效率更⾼。荧光蛋⽩在细胞或⽣物体中给予激发波长就能够发出绿⾊荧光，显⽰⽬的基因的表达情况，且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针，不会⼲扰蛋⽩检测，快捷，灵敏，⾮常适⽤于⾼通量的药物筛选。
上图两个都是带有EGFP荧光蛋⽩标签的质粒，第⼀幅图中mEGFP中m表⽰monmer单体的缩写，荧光蛋⽩的形式为单体，这在很多实验设计中⾮常重要，⽐如与⽬的标记基因组成融合蛋⽩时。两张图主要区别点在于EGFP插⼊的位置不同，⼀个在N端，⼀个在C端。pmEGF-C1中EGFP插⼊在backbone的N端，多克隆位点MCS在C端，质粒命名为C1；pEGF-N1中，EGFP插⼊在backbone的C端，MCS在N端，质粒命名为N1。
红⾊荧光蛋⽩(mCherry)
红⾊荧光蛋⽩(mCherry)
mCherry是⼀种被⼴泛⽤于⽣物技术作为⽰踪剂的红⾊荧光染料，包括分⼦的标记和细胞组分的定位等。不同于其它从维多利亚⽔母中分离的GFP蛋⽩和其它绿⾊荧光蛋⽩变体，mCherry以及其它⼤多数红⾊荧光蛋⽩是从珊瑚(Discosoma)中分离出来的蛋⽩，相对于其他荧
光，mCherry的好处在于它的颜⾊和应⽤最多的绿⾊荧光蛋⽩（GFP）能进⾏共同标记，并且mCherry相对于其他单体荧光蛋⽩来说也具有卓越的光稳定型。m就是单体的意思。
mCherry的最⼤吸收/发射峰分别位于587nm和610nm，对光致漂⽩耐受，⽐较稳定易观察。mCherry具有较快的成熟速度，t0.5为15分钟，这在⼀些需要做出快速反应的实验⾮常重要，⽐如启动⼦活性报告系统等。
mCherry也是分N端和C端的。
下图是⼤部分可⽤的荧光蛋⽩相关信息
02
pgl3—
荧光素酶
单/双荧光素酶报告基因原理
利⽤荧光素酶与底物结合发⽣化学发光的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件插⼊在荧光⾍荧光素酶上下游，构成荧光素酶报告基因质粒。然后转染细胞，适当刺激后裂解细胞，测定酶的活性强度，通过荧光素酶活性的⾼低来判断刺激前后/不同刺激对转录调控元件的影响。
双荧光素酶报告基因是指萤⽕⾍荧光素酶和海⽣荧光素酶。萤⽕⾍荧光素酶是从⾓⾍中分离得到，分⼦量为61kDa；海肾荧光素则是从海肾中分离，分⼦量为36kDa。两者不同点在于底物，辅助因⼦不同和发光的颜⾊不同。
1. 底物和辅助因⼦不同：萤⽕⾍荧光素酶(F-Luc)需要荧光素(luciferin)，氧⽓和ATP和镁离⼦同时才能
发⽣，海肾荧光素酶(简称R-Luc)仅需要腔肠素和氧⽓。
2. 发光颜⾊不同：萤⽕⾍荧光素酶产⽣光的颜⾊呈黄绿⾊，波长550-570nm；海肾荧光素酶产⽣蓝光，波长480nm。
单荧光素报告实验受到实验条件的影响不能很准确的反映试验结果，双荧光素酶报告基因通过共转染
的对照内参作为实验，尽⼒的避免了实验中细胞活性，裂解程度不同等实验误差。⼀般情况下，海肾荧光素酶基因作为内参使⽤，常常与萤⽕⾍荧光素酶共转染细胞或者是将两个荧光素酶⽤不同的启动⼦构建在同⼀质粒上，计算结果时，将萤⽕⾍荧光素酶的检测值/海肾荧光素酶的检测值。
双荧光素酶报告基因实验流程
双荧光素酶报告基因应⽤
1. 验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插⼊报告基因载体，再共转⼊该microRNA，如果荧光素酶活性下降，则提⽰为其靶序列。
2. 验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插⼊报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，
检测荧光素活性。
3. 启动⼦结构分析。将启动⼦区域序列（通常2k左右）进⾏分段截短，或对特定位点进⾏突变，再分别构建⼊luciferase报告载体，检测其启动⼦活性。
4. 启动⼦SNP分析。⼀些基因的启动⼦区域存在单核苷酸多态性，可运⽤荧光素酶报告系统分析其相对活性。
5. 验证特定转录因⼦同其调控序列的作⽤。将该序列（通常为启动⼦区域）插⼊报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因⼦，可分析转录因⼦过表达是否提⾼荧光素酶活性。
6. 可以分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建⼊报告基因载体，在不同上游信号条件下，荧光素酶活性代表了通路的下游响应。
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