朱锦灿;陈小宇;祝爱珍;刘成成;刘善淘;刘革修
【摘 要】目的 构建含有人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP4)基因启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-Ba.ic-FABP4-promoter,为脂类代谢相关药物研究提供基础.方法 根据已知人的FABP4基因启动子序列设计引物,以人DNA为模板,用PCR法扩增出人FABP4基因启动子的DNA大片段.经过限制性内切酶KpnI和XhoI双酶切后插入到pGL3-Basic载体中;测序鉴定;然后将这些重组质粒瞬时转染到K293细胞中,并在24h后检测其荧光素酶活性.结果 构建的含荧光素酶基因的质粒,经酶切及测序鉴定结果显示FABP4启动子插入的位置和序列正确.转染细胞后检测其荧光显示:重组pGL3质粒转录活性较pGL3-Basic质粒明显增强(P＜ 0.001).结论 成功构建了pGL3-Basic-FABP4-promoter质粒,为进一步研究FABP4基因的表达调控提供了工具和基础. 【期刊名称】《中国医科大学学报》
【年(卷),期】2014(043)002
【总页数】4页(P166-169)
【关键词】FABP4;启动子;荧光素酶;质粒;转染
【作 者】朱锦灿;陈小宇;祝爱珍;刘成成;刘善淘;刘革修
【作者单位】暨南大学血液病研究所,广州510632;暨南大学血液病研究所,广州510632;暨南大学血液病研究所,广州510632;暨南大学血液病研究所,广州510632;暨南大学血液病研究所,广州510632;暨南大学血液病研究所,广州510632
【正文语种】中 文
【中图分类】Q782
脂肪酸结合蛋白（fatty acid binding proteins，FABPs）是细胞质内一类相对低分子质量蛋白［1］。FABPs可以结合多种配体，主要作用是转运脂类或参与脂类代谢，调整游离配体浓度，直接或间接参与多种细胞调节过程。脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（adipocyte fatty-acid binding protein，FABP4），也称为Ap2、ALBP或A-FABP，主要在脂肪细胞中表达，
在甘油三酯形成及脂解过程中参与调控脂生成或溶解的生化过程［2］。近年来FABP4被证明与糖尿病、心血管动脉粥样硬化症等疾病密切相关［3］。因此本研究通过构建人FABP4基因启动子荧光素酶报告基因质粒（pGL3-Basic-FABP4-promoter），建立报告基因转录调控体系，以期了解影响脂类代谢相关药物对其启动子转录活性的调控，为深入研究相关疾病提供基础。
1.1 材料和试剂
pGL-3basic载体、Wizard®基因组DNA纯化试剂盒、质粒提取、纯化试剂盒购自Promega公司；T4 DNA Ligase酶、dNTPs、限制性内切酶KpnI、XhoI购于TaKaRa公司；KOD plus neo DNA Polymerase购于ToYoBo公司。E.coli DH5α菌株、K293细胞株由暨南大学血液病研究所保存，DNA凝胶回收试剂盒购自州东盛生物科技有限公司；转染脂质体Lipo-
fectamine2000购自Invirtogen公司；胎牛血清、RPMI1640、胰酶培养基购自于美国GIBCO公司产品。
1.2 基因组模板的制备
根据Wizard®基因组DNA纯化试剂盒操作方法提取人细胞基因组DNA，接着通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA纯度及完整性，置于-20°C备用。
1.3 PCR引物的设计
根据GenBank收录的FABP4启动子基因序列，用Primer 5.0软件自行设计出引物。其序列如下：上游为5′-CGGGGTACCCATTCAGAAAGGAACTTT GTTTCAAATAA-3′，含KpnI酶切位点；下游为5′-CCGCTCGAGATTATTCTTCAAGGTGAGAAGGAAG CTG-3′，含XhoI酶切位点。引物由苏州金唯智公司合成。
1.4 启动子片段的克隆
以人细胞基因组DNA为模板。根据上述引物，利用PCR扩增仪进行扩增；反应条件：94℃变性5 min；98℃30 s，58℃30 s，68℃2 min 40 s，共30个循环；68℃延伸5 min。获得一段长5 467 bp的PCR扩增产物。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳获得分离条带，参照DNA凝胶回收试剂盒的操作说明回收目的DNA片段。
1.5 pGL3-Basic-FABP4-promoter质粒构建及鉴定
用限制性内切酶KpnI与XhoI双酶切含FABP4启动子PCR回收产物及pGL-3basic载体。酶切产物经1%凝胶电泳后，回收酶切产物。将酶切回收PCR产物及载体于0.2 mL EP管中16°C连接2 h。连接产物转化DH5α感受态细胞，于含氨苄青霉素的LB培养基中选择培养。筛选阳性克隆，将所选阳性克隆进行扩增。并通过高纯度少量提试剂盒提取质粒进行XhoI单酶切鉴定，鉴定正确的克隆送华大基因公司测序验证。
1.6 细胞转染及荧光素酶活性的检测
K293细胞被培养于含10%胎牛血清的MEM培养基中（37℃、5%CO2）。在转染前将5×105个细胞接种于24孔培养板中。分别以正常K293细胞为对照组；转染空质粒pGL3-Basic的K293细胞为阴性对照组。转染pGL3-Basic-FABP4-promoter重组质粒的K293细胞为转染组。根据Lipofectamin 2000转染试剂盒说明书操作方法将pGL3-Basic-FABP4-promoter导入K293细胞。转染K293细胞24 h后裂解细胞，按照荧光素酶检测试剂盒的操作说明，在TD20/20荧光照度计上测定荧光值。
1.7 统计学处理
计量资料采用x±s表示，采用SPSS 13.0统计分析软件，采用两独立样本的t检验。以P＜0.05作为统计学显著性差异标准。
2.1 基因组DNA的PCR产物电泳
基因组DNA的PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳结果如图1。在20 kb以上出现有1条扩增条带，未出现弥散条带。
2.2 FABP4启动子扩增结果
FABP4启动子PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳结果如图2所示。在5 kb和6 kb之间出现一条清晰的扩增条带，与目的基因片段大小一致。
2.3 重组质粒酶切鉴定
经质粒提取后进行单酶切XhoI鉴定，酶切产物
于含溴化乙锭（EB）的1%琼脂糖凝胶上电泳，UVP凝胶成像系统成像结果如图3所示。图3中，FABP4（5 467 bp）在相应的位置切出一条目的条带（泳道10），说明筛到的2个克
隆均为阳性克隆。可选取作该阳性号质粒去测序。
2.4 测序结果
酶切产物经华大基因公司测序。测序结果经Blast比对，结果与NCBI上已知序列进行BLAST 99%一致，证实含FABP4启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功。
2.5 荧光检测结果
pgl3荧光检测结果如图4所示。阴性对照组的K293细胞裂解液萤火虫荧光值低，对照组组的K293细胞裂解液几乎检测不到荧光。然而转染了pGL3-FABP4-promoter重组质粒的转染组K293细胞裂解液荧光值明显高于对照组及阴性对照组，差异有统计学意义。说明FABP4启动子准确插入到了荧光酶基因上游，并对荧光酶基因的表达起到正调控作用。
FABP4属于FBBPs家族中的一员，定位于人类8q21染体区域，含有4个外显子和3个内含子，编码132个氨基酸，相对分子质量为14 588。其蛋白结构由N端的2个α螺旋和10个β折叠组成并以螺旋-卷曲-螺旋的结构域作为帽子覆盖顶部，形成一个配体结合口袋［4］。
研究发现，作为脂类的分子伴侣，FABP4在成熟的脂肪细胞中可占到总蛋白的6%［5］，是脂肪细胞分化晚期表达上调的重要蛋白之一。发现于脂肪细胞［6］及脂肪组织［7］中，并且在巨噬细胞［8］和单核来源的树突状细胞［9］中也有表达。大量动物实验和临床资料表明：FABP4水平与多种疾病密切相关，例如FABP4缺陷或给予FABP4抑制剂的小鼠胰岛素敏感性提高［10，11］，究其原因为FABP4作为脂肪酸的转运蛋白，影响着脂肪酸的代谢及脂肪酸信号，从而与糖尿病和动脉粥样硬化密切相关。另有研究发现使用FABP4抑制剂干预遗传和高脂饮食诱导的肥胖小鼠后可改善糖代谢，增加胰岛素敏感性，可有效的患有严重动脉粥样硬化和糖尿病的小鼠模型［12］。除此以外，FABP4还跟冠心病、非酒精性脂肪肝等有关［13，14］。
本实验成功克隆了FABP4启动子区的基因序列，并构建了荧火虫荧光素酶表达质粒pGL3-FABP4-promoter，通过脂质体成功转染了K293细胞，转染后24 h进行荧光素酶检测发现：转染了pGL3-basic空白质粒的对照组没有荧光素酶报告基因的转录活性；而转染了pGL3-FABP4-promoter重组质粒的实验组能观察到有显著的转录活性，表明FABP4启动子的活性驱动了荧光素酶的表达，证明了本研究构建的重组FABP4启动子片段有良好的启动活性。
综上所述，本研究建立了FABP4启动子荧光素酶报告基因重组质粒，可用于对FABP4启动子的进一步研究中。为以后构建通过检测FABP4启动子活性筛选FABP4抑制剂的方法提供实验基础，以达达到FABP4相关疾病的目的。
【相关文献】
［1］Van NieuwenhovenFA，Vander Vusse GJ，Glatz JF，et al.Membrane
associated and cytoplasmic fatty acid binding proteins［J］.Lipids，1996，31（Suppl）：S223-S227.
［2］Hertzel AV，Bennaars-Eiden A，Bernlohr DA.Increased lipolysis in transgenic animals overexpressing the epithelial fatty acid binding protein in adipose cells［J］.J Lipid Res，2002，43（12）：2105-2111.
［3］Roden M.Blocking fatty acids'mystery tour：a therapy for metabolic syndrome?［J］.Cell Metab，2007，6（2）：89-91.
［4］Reese-Wagoner A，Thompson J，Banaszak L，et al.Structural properties of the adipocyte lipid binding protein［J］.Biophys J，1999，1441（2-3）：106-116.
［5］Makowski L，Hotamisligil GS.Fatty acid binding proteins-the evolutionary crossroads of inflammatory and metabolic responses［J］.J Nutr，2004，134（9）：2464S-2468S.
［6］Makowski L，Boord JB，Maeda K，et al.Lack of macrophage fatty-acid-binding protein aP2 protects mice deficient in apolipoprotein E against atherosclerosis［J］.Nat Med，2001，7（6）：699-705.
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