第495年第月期
贵州医科大学学报
Vol.44 No.3
年'月
JOURNAL OF GUIZHOU MEDICAL UNIVERSITY
2778.3
-基础研究•
家蝇Actig-CC 基因启动子的生物信息学分析及载体 构建* ** 7基金项目］国家自然科学基金（1560253）* *通信作者 E-maii : 1gmxP27@ sina. com
王蓝晨，王昱，王颖，杨仕赛，朱贵明…
(贵州医科大学生物与工程学院实验中心，贵州贵阳550025)
［摘 要］目的 运用生物信息学分析家蝇(Musco domestico L.)肌动蛋白2C(Actig-bC)基因，构建Actig-bC 启
动子双荧光素酶报告基因表达载体。方法 使用伯克利果蝇基因组计划(BDGP )在线分析软件'Promoter 2.0和
在线比对启动子网站(FPROM)等多种启动子预测工具，分析、预测家蝇肌动蛋白A c 0c -5C 基因5，端上游非编码 区，根据预测结果构建截短式启动子萤火虫荧光素酶报告基因重组质粒，转染草地贪夜蛾卵巢细胞系ee 细胞， 并使用反转录聚合酶链反应(RT-PCR )进行萤火虫荧光素酶报告基因的检测。结果Aetm-5C 基因5，端上游的 -2 609 - -94 bp，预测有启动活性，且分值达0 8分以上，其中-2 198〜-2 109 bp 分值最高、达0 98分；在- 220 bp 和-1 444 bp 处分别检测到CAAT 和TATA 盒信号，经比较取最有可能的1 156 bp ( - 1 236 --80 bp)、 1 745 bp ( - 1 825 - -80 bp )及 2 555 bp ( -2 139 - -80 bp)截断启动子片段，构建 pGL3P156、pGL3-t745 及
pGL3-2459质粒.RT-PCR 检测到3种重组质粒中的萤火虫荧光素酶报告基因转录成功。结论 生物信息学预测
工具研究家蝇AiSC 基因启动子可以简化认知基因的过程，根据预测结果构建了家蝇ActibC 基因萤火虫荧
光素酶报告基因表达载体。
［关键词］家蝇；计算生物学；逆转录聚合酶链反应；肌动蛋白5C 基因；启动子；重组质粒
［中图分类号］R384 ［文献标识码］A ［文章编号］2096-8388(2421)43b263-P6
DOI ：10.19367/j. cnkd 0096-5338.0021.03-053
Bioinformatics analysis and carrier construction of
Actin-5 C gene prrmotrr of housefly
WANG Lanchex, WANG Yp, WANG Ying, YANG SSisaf, ZHU Guiming
(ExpePmerai Center , Collepn of' Biology and Enginering , Guizhol MePical University , Guiyyng 550025, Guizhol , China)
7 Abstruci ］ Objective To analyoe A c U o -S C geae of musca domestica by Uioinfounaticu t
o ups W o U
the expression vectoo of A c U o S C promoteo ponpie luciferase upo U pt geae. Methods The upstream non-coUing region of actin A c U o S C gene 5 of houseOy was analyzed and predicted by a ^50)of
promoter prediction toois suc S i as the BerOeley DrosopPila Gexome Project ( BDGP ) online analysis software , Promoter 2.0, and online compausou promoter wedsite (FPROM). A recombinant plasmid
of luciferase repoVer geae of firefy was constuicted and transfected into the si celis of ovvo celi line of spoUopdu fuiuinerVa. The irefy lucimrase repoVer geae was detected by reverse transcuptiou
polymerase chain reaction (RT-PCR). Results The upstream -2 609 - -94 bp of A c U o -PC geae 5 "pudimed puming activity with a score adove 0. 8. Among them, - 2 158 - - 2 159 bp score was higUest with a score uaching 0. 98. The box signals of CAAT and TATA were detected at -220 bp and - 1 444 bp uspetdOy. The most lidely t 156 bp( - 1 236 --8 bp) ,1 745 bp( - 1 825 - -
88 bp ) and 2 052 bp ( - 2 136 - - 88 bp ) truncated promoter fragmexts were compared to constuci plasmid of o GL3-1156, pGL3-1745 and pGL3-2059. RT-PCR detected saccessful transcription of firefy
223
贵州医科大学学报44卷
lucimraso dpo D o yeoa in3recambinani plasmids.Conclusion BioinO)Dnatics preXiction toots ta stuUy thc of Actin,-5C yeoa of domesUc Oy can simplify thc process of cognitive yeoa. AccorOina ta thc preOicted dsu U s,thc cxyression vc W s of Actm-BC yekc0100lucimraso dpo D cs yeoa isand thc basis fp fsthy exyloration of thc activita of thc yeoa
is provideO.
[Key words]honsOy;computationai bmmgy;reverse W poc D p W so10—0X10chain reaction(RT b PCR);actin,-5c yeoe;promoter;recombinani plasmid
家蝇(Musca domestica L.)属于完全变态昆虫，是世界大部分地区最常见的一种昆虫［］。家蝇具有生育能力强、生命周期短、易于高密度培养等特点，且育种技术简单，饲料来源丰富，已被列为世界上
新的蛋白质资源昆虫［-4。因此将家蝇作为一种新型的转基因生物反应器进行研究，具有广阔的发展前景。昆虫转基因技术是利用功能基因开发新昆虫品种的关键，也是实现昆虫有用蛋白质合成和生物反应器开发的关键技术［「6。外源基因能否成功表达，启动子的选择显得尤其重要。目前，对家蝇的转基因研究相对不成熟，技术体系的建立尚不完善，仍缺乏能够实现外源基因高效表达的理想启动子。在果蝇和家蚕中，肌动蛋白(Ac-in)是一种具有收缩特性的高度保守的组成型蛋白，肌动蛋白除存在于肌肉细胞中，还是细胞骨架的重要组成部分、参与细胞迁移、染体分离及细胞内大分子转运等［］。肌动蛋白5C(Acan-5C)属细胞质肌动蛋白，通常认为将它祝为表达外源目的基因的启动子比较合适［12-11］。本研究使用多种预测工具预测Actin-5C启动子区，并克隆预测调控区域，重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因pGL3-Babc载体上，为进行下一步的实验研究筛选出启动子活性最强的家蝇AciBC启动子的调控区域。
1材料与方法
1•1材料
1.1.1家蝇及细胞来源供试虫源家蝇由贵州医科大学生物与工程学院昆虫房饲养，温度25〜25C，湿度70%，光照周期12L：12D。供试细胞si(草地贪夜蛾)为贵州医科大学生物与工程学院实验室保存。家蝇幼虫经麦麸饲养，家蝇成虫以白糖和奶粉以1：比例混合进行饲养，饮用水为无菌蒸馏水。
1•1•2主要试剂荧火虫荧光素酶报告基因载体pGLg-Bn-P和pGL3-P厂omoa厂购于美国Promepa公204司,Q5®超保真2x预混液、限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自美国NEB公司，DNA Marder、纯化回收试剂盒及2x Tan PCR MasterMio H购自天根生化科技(北京)有限公司，氯化钠、酵母粉及胰蛋白胨购自英国Oxid公司，琼脂糖购自中国bic-shas公司，DNA抽提试剂盒购自德国QIAGEN。胎牛血清(fetal bcvine seam,FBS)购自德国PAA 公司，Grace)昆虫培养基和细胞转染试剂购自美国TheDnc Scieotific TM公司。PPmer5.4设计引物(表1)、引物合成及基因测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
表1PCR实验中使用的引物
Tab1PDmers useO in PCR expeDmeots
基因名称引物序列
产物大
小/bp pGL7-I182上游:ATGGTACCCTCTCTITCGTGATITGTrGTrGC
下游:GCGCCTCGAGATGTTAGCGAAGAAAAAAA
1156 pGL3P749上游:AGGTACCTCCGCACAGTTCGAGATA
下游:GCGCCTCGAGATGTTAGCGAAGAAAAAAA
1749 pPLL-5252上游:GCGGTACCTTGACCTTAGAAGCGAAAA
下游:GCGCCTCGAGATGTTAGCGAAGAAAAAAA
2552
1.1•3主要仪器ApplieO Biosystems PCR仪购自美国TheDnc Scieotific TM公司，DYY-BC型电泳仪购自北京市六一仪器厂，MilO-Q超纯水仪购自德国Milliporo Pharmacia，超净工作台购自苏州安泰空气技术公司。
1.2方法
•2.1启动子分析在美国国家生物信息中心(nationat ceotar for bmtechkomgy information,NC-BI)数据库中检索家蝇肌动蛋白Actin-5C基因gD-NA序列，使用生物信息学预测工具分析得到启动子区，其中启动子转录起始位点预测使用的是Promoter2.4(htty［//cww.chs.dtu.dk/sepices/Pra-moter/)，启动子预测分析使用伯克利果蝇基因组计划(berdemy drosophZa yeoome project,BDGP)在线分析软件，以及Softhexp 启动子预测分析工具包
3期王蓝晨等家蝇ActinPC基因启动子的生物信息学分析及载体构建
(包括TSSG、TSSP和FPROM)，转录元件的预测使用的是Cister(https：//zin.bu.Cu/~mfeth/cis-tea.shtmi)。
1・2・2荧光素酶载体构建Pemer5.0软件进行引物设计,DNASTAR软件行酶谱分析，在上游和下游引物5，端分别引入Xho I和Ken I限制性内切酶酶切位点和保护碱基(表1)。提取家蝇成虫DNA并以此为模板，采用超保真聚合酶扩增相应的目的片段。PCR条件为98七变性10s,64七退火3。s,72°C延伸50s，共35个循环，最后6七保存。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR 产物。Xho I和Ken I内切酶双酶切PCR产物及载体pGL3-Basic纯化回收后进行连接反应，得到的质粒分别命名为pGL3-n56、pGL3B745及pGL3-2256三种质粒，重组质粒经Xho I和Kpa I双酶切及测序进行鉴。
1.2.3瞬时转染细胞及荧光素酶基因的表达取s I细胞以1xl05个/孔密度接种于6孔板中，细胞96%融合时，加无血清无双抗Grace's培养基100孔，再加空载体pGL-Baste和pGLL-PTa-motrs各6Rg作为对照组，6GL3-^56、pGL3B745及pGL3-2059各6隅为实验组，转染时加内参载体pPRL-PK460nq和Linofectamine200012»L，补充无血清无双抗的培养基250r L，置28C孵箱培养。6h后弃培养液，换完全培养基。24h后提取细胞总RNA，反转录聚合酶链反应(reversa tran-sception-oolymerasa chain reaction,RT-PCR)检测萤火虫荧光素酶基因的表达情况，上游引物Fluc-2为5，TGCCTCATAGAACTGCCTGCGTG3S下游引物Fluc-R为5，TATCATCCCCCTCGGGTGTAAT-CAG3，。PCR扩增时66C退火，延伸46s，循环3。次，产物长度为42。bp；并以Pactin作为内参照，
上游引物Pactin-2为5'GATGACCCAGATCAT-GTTTGAGACC3'，下游引物0actin-R为5,TGT-CACGCACGATTTCCCTCTC3，PCR扩增时62C退火，延伸12s，循环30次，产物大小约为250bp。结束后取反应液5r L进行浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统检测PCR产物。
2结果
2.1家蝇Actin-0C基因定位及启动子分析
在线软件NCBI对Acin-OC(NW_00677646))基因结构进行分析，结果显示Actin-0C基因在Gen-Bank数据库中位于Scaffold20356上，基因全长为5356bp。使用BDGP在线分析Actin-0C基因启动子，以Actin-OC基因转录起始密码子(ATG)的第一个碱基A作为+1,Actin-OC基因5'端上游-2606~ -66bp区域内有启动子活性，且启动子分值达0.8以上，其中-2198~-2148bp时的分值最高，达到0.98(表2)。使用软件TSSG、TSSP、Promoter2.0和FPROM预测Actin-OC启动子基因序列，将预测结果汇总后制图(图1)。使用Cister预测转录元件，在-22。bp处检测到CAAT盒信号；在-246bp处检测到TATA盒信号(表3)0经比较取最有可能的1156bp(-1236~-80bp)、1775bp (-2825~-80bp)和2059bp(-2139~-80bp)截断启动子片段构建pPL3B156、pGL3B745及P GL3-2059三种质粒。
表2BDGP启动子预测工具预测Actin-OC基因
非编码区序列中的启动子
Tag.2BDGP promotea ppUictmn tool foa Actin-O
in non-coninq reeion sequeace
atttatctaaatttctttaaaaaaaatmyaaaaymctceyaaact
C peomohee
起始位终止位评分/
点/bp点/bp分
-2550-2502 2.64
-2139-2086 2.96
-2235-2995 2.99
-2866-2 2.72
-2652-2582 2.55
-
650-962 2.92
-634-554 2.72
-214-164 2.82
-55-33 2.55
caaatctgaatc c atcc a aaaaaggc c atctagc o caag t tgeatt
tttcrtmemtaaaatataacttcccctattaaaayaccartccca
gc c aaagaacttc t catatctatgtggc o gc a aag t haaaatagc a aa
tttttctmaaayaatttacaaaaccccccattatcttyaaaatamhta
tc t tcag t catcag a aataaatacac o gtac o ctaatatttttttttc
tttttc a attaaaamtatatattmr y ctmmttycc t ac c tagc t
tc a tttcttmtaaaataaataagycataaatmaacc a ge a atcaaat
启动子序列
cagccaaatattaggctattaaaactctgcoaaagtcttcttggccact
s
B
■
■
E
图1多种启动子预测软件预测
Actin-O C基因启动子
Fie.1A vveeta of promotea preaiction softwne ta predict the Actin-O C geaa promotea
265
贵州医科大学学报46卷
表3 Cister 预测转录元件列表
Tad. 3 Cister pudictde tunscVpdme list 元件
位置/bp
序列
评分
E2F
-1 855 〜——1 844tadgcygc 100.83Mef-2
-1 841 ---1 830ttaaanatagca 0. )6LSF -1 264 -‘ -1 250gcactaagagccagt 0. )6NF-l -3 116---3 099
cad c a tttttyc c a nty
0. )6TATA -1 335 ---1 371ccctycdtatd 0. )7CCCAAT -101 --—146
gadaccaatgggctt 0. )7SRF
-3 H ---3 027tccadgatggtg
0. )7Tef -3 046 ---3 036
cacactccattg 0. )4SRF
—1 440 ---1 448gaccatatatgg-0. )7Ed -1 396 ---1 336
cytttcccctc
0. )7E2F
-3 079 ---3 068ttcygcytccaa 0. )7ERE -1 066 -，-1 053
ggcctggctgcgcc 0. )7CRE -3 032 ---3 021ggtydgdaty
0. )7Tef
-3 099 ---3 08uauuduy 0. )1Ed
-
3 014 ---3 004c a cid d e a
0. )1LSF -3 115 ---3 185
gctytytggaaatgg 0. 10GATA
-1 136 -，-1 174gWyatatctycc 0. 10
CRE -3 032 ---3 021
ggtydgdaty
• 10
2・2家蝇Actio-2C 转基因载体的构建
提取家蝇基因组DNA，并根据已经报道的Ao-
eobC 基因预测启动子区，以家蝇基因组DNA 为
模板进行PCR 反应，PCR 产物与载体pGLla ） 经同样的酶切回收，回收片段大小分别为1 156、
1 745及0 45
2 bp，片段大小正确；将回收后的目的
片段连接到报告基因pPL3-Pasic 载体上，转化筛选
单克隆并提取阳性重组质粒，得到的重组质粒
pGL3P 182,,Gg3-l 745,pGL3b 059，片段大小正
确；经Blast 比对分析结果显示碱基序列正确，表明
重组质粒构建成功。见图2和图3o
22荧光素酶编码基因的转录检测
将3个重组质粒转染ou 细胞后RT-PCR 逆转
cDNA ，以cDNA 为模版检测荧光素酶编码基因，转
录结果表示3个重组质粒载体转录成功（图4）。
A
7 000 bp
5 500 bp 3 500 bp 2 000 bp 1000 bp
500 bp
M DNA
B
C 4 500 bp 3 000 bp 2 000 bp 1200 bp
8 00 bp 5 00 bp 2 00 bp
M(bp)
1000 bp
500 bp
7 000 bp 5 500 bp 3 500 bp 2 000 bp D
4 500 bp
3 000 bp
2 000 bp 1200 bp
800 bp 500 bp
200 bp
注:A 为家蝇基因组DNA ,B 为酶切PCR 产物,C 为重组质粒,D 为双酶切鉴定;M 为DNA 分子量标准MaUer
图0启动子重组质粒构建
Fig. 0 Coustructiou of ucombinavt plasmid using promoter
226
3期王蓝晨等家蝇AcanBC基因启动子的生物信息学分析及载体构建
800820840
.TATATGCCACCAAGGTTTTCCCAATGTTCGGGGATAGGGGCCACACAATTTCC 质勵G Z3-1156
质勵G E3-1745
八/xmw、八叽
质勵G Z3-2059
图3重组质粒的测序结果(节选)
Fiy.3Seyueocina results of recombinani plasmids(Exce/ti)
A
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M1234567
B
pgl32000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
M1234567
注:A为RT-BCR检测结果,B为内参;M为DNA分子量标准皿&/0、,1为阴性对照,2为未转/9,3为pGL3P a P, 4为重组质粒pGL3P156,5为重组质粒pGL3P745,6为重组质粒卩6厶3-2059,7为阳性质粒pGlLP5mi。
图4RT-BCR检测重组质粒
Fiy.4RT-BCR detection of recombinani plasmids
3讨论
具有转录起始特异性的启动子是位于结构基因5末端上游的非编码DNA序列，可以活化RNA 聚合酶并使RNA聚合酶精确结合DNA模板，是基因转录调节的核心区域［12-15］；真核生物启动子在转录调节中有着非常重要的作用，是RNA聚合酶特异性结合位点的转录调控元件［15-15］。利用生物信息学预测启动子，对于基因转录调控机制的研究这是一种重要的方法，它可以有效地从基因组中到已知和未知的转录调控元件，为基因结构和功能的研究提供可靠的依据少"7。在真核基因表达调控系统中，基因转录的起始和调控主要通过顺式作用元件、反式作用因子和RNA聚合酶的协同作用实现［5］。顺式作用元件在起始位点和基因转录的转录效率中起决定性作用［5］，并且基因的转录起始通常通过启动子实现［2］。启动子序列由核心元件TATA盒、正向核心启动子元件BRE、反向启动子元件DPE、启动子、CAAT盒和GC盒组成，这些都是通过生物信息学研究启动子的重要信息［41■47］。本研究在NCBI数据库对Actin-5C基因结构定位分析，对ActinBC基因5端正向3595bp 序列进行分析，发现该基因的启动子区和核心启动子区；利用Promoter2.4软件预测该基因的转录起始位点；通过Cister软件预测，对非编码区序列进行分析，发现ActinBC基因有TATA盒信号，也有CAAT盒信号，经预测评分初步确定Actin-5C启动
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