胡晓璐;刘淑集;吴成业
【摘 要】通过单因素和正交试验研究了鱿鱼精巢提取鱿鱼鱼精蛋白的优化工艺,并对优化工艺提取的鱿鱼鱼精蛋白进行了分析.结果表明,最佳提取工艺为硫酸浓度0.3M、硫酸用量为3倍、提取次数2次、冷乙醇用量为3倍;该条件下,鱿鱼鱼精蛋白的得率为3.42％,蛋白质含量达93％,且氨基酸组成齐全,碱性氨基酸占26.20％,其中精氨酸占9.61％,Tricine-SDS-PAGE电泳结果分析表明其组成成分比较复杂. 【期刊名称】《福建水产》
【年(卷),期】2013(035)006
【总页数】7页(P434-440)
【关键词】鱿鱼;鱼精蛋白;提取工艺;氨基酸;Tricine-SDS-PAGE
【作 者】胡晓璐;刘淑集;吴成业
【作者单位】福建农林大学食品科学学院,福建福州350002;福建农林大学食品科学学院,福建福州350002;福建省水产研究所,福建厦门361013;福建省水产研究所,福建厦门361013
【正文语种】中 文
【中图分类】S985.9
鱼精蛋白(Protamine)是一种碱性蛋白，是存在于各种动物精巢组织中的多聚阳离子肽，并与DNA结合成核精蛋白形式存在。目前已经从鲑鱼、鲱鱼等多种鱼类及其它水生动物中提取到了鱼精蛋白。鱼精蛋白在医学上有着重要的应用，如从鱼类精巢提取的鱼精蛋白硫酸盐是体外循环心脏手术中唯一对抗肝素的药物，能抵消肝素或人工合成抗凝血剂的抗凝作用[1]；鱼精蛋白还具有抗肿瘤、缓解疲劳、增强肝功能、刺激垂体释放促性腺激素等功效，对男性不育症也有一定效果[2-3]；另外，鱼精蛋白还具有良好的抗菌特性，可作为一种天然的食品防腐剂，应用于各类食品的防腐保鲜中[4]。本研究以鱿鱼的精巢组织为原料，开展鱼精蛋白的提取及工艺优化，并分析鱿鱼精蛋白的理化特性，本研究结果可为鱿鱼加工副产物的高附加值利用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
鱿鱼精巢：晋江市闽南水产开发有限公司提供。
蛋白质标准品SM1861：分子量为1700-40 000 Da，Fermentas公司；三羟甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠、N,N,N,N-四甲基乙二胺、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸，sigma公司；其他化学试剂均为国产分析纯。
5804R离心机：德国Eppendorf公司；PB-10 pH计：德国Sartorius公司；凝胶成像系统：上海天能科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 原料选择与处理
将鱿鱼精巢解冻，清洗，去除结缔组织、腺体、脂肪等杂物，沥干水分，如不立即使用，-18℃冻藏备用。
1.2.2 原料基本营养成分的测定
水分：GB5009.3-2010第一法直接干燥法；蛋白：GB5009.5-2010第一法凯氏定氮法；脂肪：GB5009.6-2003第二法酸水解法；灰分：GB5009.4-2010食品中灰分的测定。
1.2.3 鱿鱼鱼精蛋白提取工艺
工艺流程：精巢组织→搅碎→缓冲液匀浆→过滤→离心→硫酸溶液提取→离心取滤液→冷乙醇沉淀→丙酮洗涤→乙醚洗涤→干燥→鱼精蛋白
称取100 g鱿鱼精巢于组织捣碎机中，加入300 mL 75 mM NaCl(其中包括25 mM乙二胺四乙酸二钠和 0.5 mM苯甲基磺酸氟，pH=8.0)缓冲液匀浆2次，每次30 s，用4层纱布过滤，离心弃去上清液，沉淀重复溶解，离心取沉淀。加入一定量硫酸溶液在一定温度下提取一定时间，10 000 r/min 4℃离心20 min，过滤上清液，离心后的沉淀重复操作几次，将滤液合并，减压蒸馏浓缩，加入一定体积的95%冷乙醇，4℃过夜，离心所得沉淀用适量水溶解并中和后再用同样倍数体积的95%冷乙醇沉淀，离心后取沉淀用丙酮洗涤2次，乙醚洗涤1次，鼓风干燥即得到鱿鱼鱼精蛋白。
1.2.4 单因素和正交试验设计
分别考察硫酸浓度、硫酸用量、提取时间、提取次数、提取温度、乙醇用量各单因素对鱿鱼鱼精蛋白得率的影响；在单因素试验的基础上，选取硫酸浓度、硫酸用量、提取次数、冷乙醇用量作为四因素，设计L9(34)正交试验，进行工艺优化。
1.2.5 鱿鱼鱼精蛋白得率测定
蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G250染法[5]。
鱼精蛋白得率
公式(1)
1.2.6 鱿鱼鱼精蛋白氨基酸组成分析
采用GB/T 5009.124-2003食品中氨基酸的测定方法测定。
1.2.7 鱿鱼鱼精蛋白Tricine-SDS-PAGE电泳分析[6]
5%浓缩胶和18%分离胶，浓缩胶电流30 mA，分离胶电流60 mA，10×Buffer电极缓冲液(
含100 mM Tris，100 mM Tricine，0.1%SDS，pH 8.3)用时稀释至一倍，固定液含50%甲醇、10%冰乙酸、5 mM乙酸铵水溶液，考马斯亮蓝G250溶液染，天能自动凝胶处理系统拍照并计算分子量。
2 结果与讨论
2.1 鱿鱼精巢基本营养成分
表1 鱿鱼精巢的基本营养成分Tab.1 The basic nutrients of squid testis成分Composition水分Water粗蛋白Crude protein粗脂肪Crude fat灰分Ash其他Other含量Content76.23%17.32%1.65%2.48%2.32%
注：各组分含量按湿重计。Note: The content of every composition was counted on wet weight.
鱿鱼精巢的基本营养成分如表1所示，其含水量达76.23%。通过计算，鱿鱼精巢粗蛋白占精巢干重的72.86%，并含有少量脂肪，占干重的6.94%，说明鱿鱼精巢是一种蛋白含量高而脂肪含量低的产品。另外，鱿鱼精巢灰分含量较高，占干重的10.43%，吴燕燕等[7]研究
了鱿鱼精巢核蛋白及鱼精蛋白的营养成分，其含有Fe，Cu，Zn等多种微量元素。
2.2 鱿鱼鱼精蛋白提取工艺单因素试验
2.2.1 硫酸浓度对得率的影响
由图1可知，随着硫酸浓度从0.1 M增加到0.4 M，鱿鱼鱼精蛋白得率先升高后降低，且在0.2 M附近最高，最高值为3.10%；硫酸浓度在0.5 M处和0.4 M处的蛋白得率相比略有升高但不明显，说明硫酸浓度选择0.2 M比较合适。
2.2.2 硫酸用量对得率的影响
由图2可知，硫酸溶液用量从1倍增加到3倍，鱿鱼鱼精蛋白得率逐渐升高，当用3倍硫酸提取时，得率为3.14%；当继续增加硫酸用量，达4～5倍时，鱼精蛋白的得率略有降低，说明过多地增大硫酸溶液用量无益于蛋白得率的提高，反而造成试剂浪费和操作不便，故选择3倍硫酸溶液比较合适。
2.2.3 提取时间对得率的影响
由图3可知，随着提取时间从0.5 h延长到2.5 h，鱿鱼鱼精蛋白得率呈下降趋势，说明延长提取时间不能提高鱿鱼精蛋白的得率，若提取时间过短，反应不充分，提取出来的鱼精蛋白稳定性不好及溶解性差，故选取提取时间为0.5 h比较合适，此时鱿鱼鱼精蛋白得率为3.29%。
2.2.4 提取次数对得率的影响
由图4可知，随着提取次数从1次增加到3次，鱿鱼鱼精蛋白得率逐渐升高；继续增加提取次数，鱿鱼精蛋白的得率趋于缓和，超过3次后增加提取次数对蛋白得率升高影响不甚明显，故以提取3次为佳，此时蛋白得率为3.33%。
蛋白精
2.2.5 提取温度对得率的影响
由图5可知，温度对鱿鱼鱼精蛋白得率的影响比较复杂，加热及硫酸作用会引起原料中蛋白质逐渐变性，致使得率逐渐降低，当温度超过50℃后得率又开始升高，可能是高温破坏了原料中与杂蛋白其它物质相连接的链，使得蛋白质释放出来引起提取率升高，但高温提取的蛋白质较低温提取的蛋白质颜较黄，且复水性不好，因此，选择室温25℃提取为宜，此时蛋白得率为3.10%。
2.2.6 乙醇用量对得率的影响
由图6可知，随着冷乙醇用量的增大，鱿鱼鱼精蛋白得率呈增长趋势，用量3倍时得率达到高点，继续增加冷乙醇用量，鱼精蛋白得率增加不明显，从经济和效益角度考虑，选择乙醇用量3倍为佳，此时蛋白得率为3.14%。
2.3 鱿鱼鱼精蛋白提取工艺正交优化试验
综合单因素实验结果，选取硫酸浓度、硫酸用量、提取次数及冷乙醇用量为四因素，进行正交试验，结果见表2。从表中可以看出，在9个试验设计组中，第8组的提取效果最好，蛋白得率达到3.20%；其次为第3组，蛋白得率达到3.10%；得率达到3.00%的还有第6组。由极差分析图7可知，影响鱿鱼鱼精蛋白得率的因素主次为：D>B>A>C，即：冷乙醇用量>硫酸用量>硫酸浓度>提取次数。由图7正交表中各因素水平与蛋白得率变化趋势图可知，鱿鱼鱼精蛋白提取最优工艺组合为A3B3C2D3，即硫酸浓度为0.3 M、硫酸用量为3倍、提取次数为2次、冷乙醇用量为3倍。该工艺条件下提取鱿鱼鱼精蛋白得率可达3.42%，高于各试验组中鱿鱼鱼精蛋白的得率。
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