液体菌种制作规程
工艺流程：斜面菌种→初级摇瓶种→二级摇瓶种→发酵罐深层发酵种→接种 一、摇瓶种的制作
1斜面菌种准备：马铃薯200克（去皮切块煮沸过滤取滤液），蔗糖20克，麸皮30克（煮汁过滤取滤液）二氢钾2克，硫酸镁1克，琼脂20克，VB1 10毫克，水1000毫升。25度培养7天备用。
2、初级摇瓶制作 ①配方 土豆200克 葡萄糖20克
酵母膏 2克 蛋白胨3克 磷酸二氢钾2克 硫酸镁1克
VB110毫克 水1000毫升。（配方2：玉米粉4%，蔗糖3%，麸皮2%，酵母膏0.5%，2氢钾0.25%，硫酸镁0.1%，VB1 0.01%，豆油0.05%）。
②制作：土豆去皮切成薄块，煮沸后保持20分钟，四层纱布过滤后取滤液，补足1000毫升水，称取其他成份，与土豆液充分搅匀然后装入三角瓶。
初级摇瓶采用500ml三角瓶，装入200ml,放入玻璃球5粒（0.5cm直径）用二层纱布包裹制作棉塞，塞紧棉塞后再用二层纱布外层加报纸做罩，扎紧瓶胫，防止摇动时棉塞活动。
③灭菌：把三角瓶放入立式高压锅，加足水紧好盖，开启放气阀，接通电源，有蒸汽冒出时关闭放气阀，待压力表达到0.05MPa时,断掉电源,打开放气阀,放冷空气至压力表回0，再关闭放气阀，接通电源，当压力表显示0.11 MPa，温度达到121℃后开时计时，保持45min。断电使其自然降至0.02 MPa时放气归0，趁热微开盖，使剩余蒸汽烘干棉塞，然后出锅降温至25℃即可接种。
④接种：首先，封闭接种室，用开启紫外线灯30分钟，再用臭氧灭菌器灭菌60分钟或用烟雾剂每立方5克熏蒸30分钟，进行接种环境灭菌。把灭菌后的三角瓶放入超净台（或接种箱）,把斜面母种、工具、酒精灯、75%的酒精棉球瓶同时放入，母种用灭过菌的报纸遮盖，打开紫外线灯和无菌风开关，保持15min后，关闭紫外线灯进行接种。操作人员应着干净的隔离衣，带好卫生帽、口罩，手洗净，用75%酒精擦拭手、母种试管、工具，点燃
酒精灯，灼烧工具及试管口20秒，在严格无菌操作程序下，把斜面菌种切割成0.5厘米小块（不带培养基），移入三角瓶中，使其浮在液面，一般接入5-6块，塞好棉塞，接完后重新封好棉塞罩，放到25℃恒温环境净置培养72小时。
⑤初级摇瓶培养。当静置培养72小时后，液面菌种长到1厘米大，无污染，即可将三角瓶放到小型摇床上，一般能放6瓶（也可使用电磁摇床），固定好三角瓶，保持培养温度25℃，启动开关，调速至140r/min，培养96小时，当菌液颜清亮、菌球密集，占整个培养液的80%以上，瓶口处有很浓的菇香味，可作为二级摇瓶扩大培养的种子使用。
⑥二级摇瓶制作培养：二级摇瓶菌液配方与一级相同，5000ml三角瓶装液2000ml放入玻璃球8-10粒，灭菌压力、时间同一级，接种在无菌条件下迅速将一级摇瓶种倒入二级摇瓶中，接种量10%，塞紧棉塞绑好棉塞罩，即可放到大型摇床培养，大摇床一般放入4-5瓶，保持环境温度25℃，转速140r/min，培养72--96小时。
72小时后，菌液颜变清亮，菌球小而均匀密集，占菌液的80%以上，瓶口有明显菇香味，既为合格的液体摇瓶种，可以用于发酵罐扩大培养。
二、发酵罐深层发酵扩大培养
（一）液体罐培养基配方：玉米粉4%，麸皮2%，蔗糖3%，酵母粉0.5%，磷酸二氢钾0.25%,硫酸镁0.1%,VB10.01%.豆油0.05%。
（二）制作方法：按发酵罐最高70%的容量确定需要制作的菌种量，按比例称取各种原料，用2层纱布做袋，把玉米粉和麸皮分装两袋放入煮锅中加足水，开锅沸腾后保持30min，摆动纱布袋使营养充分溶于水中，然后控水取出，最后把剩余其它成份先溶于2L水中搅匀加入煮锅内，开锅搅拌均匀，既可入罐灭菌。
（三）发酵罐的准备
1、发酵罐的清洗和检查
（1）、发酵罐在每次使用后或者再次使用前都必须进行彻底的清洗。除去罐壁的菌球和菌块，料液和其他污染物，对于内壁的菌球可以用木棒包扎软布擦拭，洗罐的水从罐底排出，如果有大的菌料不能排出，可以卸下罐底的接种管线排出菌料。
（2）、发酵罐的气密性检查
关闭发酵罐所有阀门，稍微打开进气阀门，开启打气泵，让发酵罐压力缓慢上升至0.1Mpa后，关闭空气进气阀门保压,用肥皂水喷洒与发酵罐上的法兰连接处、焊接处、压合密封面处，逐一检查以上的地方是否有肥皂泡吹起以确定罐体的严密性，若有漏气现象应立即排除。 （3）、发酵罐的控制柜和加热棒检查
发酵罐清洗完毕后加水以超过加热管为宜（绝对禁止加热管干烧）然后启动设备，检查控制柜，加热管是否正常，各个阀门无渗漏，检查合格后方可工作。
2、发酵罐煮罐
正常生产不需要煮罐，上一次生产完毕,只需要将罐洗净就可以进入下一批生产。如果有下列情况之一的需要煮罐。
新罐，初次使用；上一次污染的发酵罐；更换生产品种的发酵罐；长时间不使用的发酵罐。
煮罐是对发酵罐进行预消毒的过程，具体操作方法：
（1）、关闭发酵罐底部的接种阀门，进气阀门，把水从发酵罐口加入至视镜中线，盖上发酵罐口盖子，拧紧，打开发酵罐夹套排气阀门和发酵罐排气阀门。
（2）、启动电源，打开控制柜“灭菌”键，此时进入灭菌状态。
(3)、当温度升到100℃夹套有蒸汽冒出时,关闭夹套排气阀门的开度，保证发酵罐内冷空气排净并保证有蒸汽流通。
(4)、当控制柜显示屏幕上显示温度123℃，压力表压力达到0.12Mpa时控制柜自动倒计时，屏幕上可以显示发酵罐温度和倒计时时间，当倒计时时间显示为0时，控制柜自动报警，此时发酵罐灭菌结束。关闭加热棒、关闭发酵罐排气阀门，闷20min后打开排气阀门和接种阀门，放掉发酵罐内压力和水，煮罐结束。
3、发酵罐空消（内胆、过滤器、管线的消毒）
发酵罐空消是对发酵罐进行设备消毒灭菌的过程，对于放置一周不用的发酵罐或者是因为停电使空压机（打气泵）停止运转的发酵罐都需要进行发酵罐的空消操作，具体的操作方法：
（1）、关闭发酵罐除夹套排气门外的所有阀门，拧紧发酵罐罐口盖子。
（2）、启动电源，打开控制柜“灭菌”键，此时进入灭菌状态。
（3）、当温度升到100℃夹套有蒸汽冒出时关闭夹套排气阀门，此时给夹套升温升压，当夹套压力达到0.05Mpa以上时,不要超过0.1Mpa缓慢打开夹套进过滤器阀门,打开过滤器尾阀门.
（4）、当过滤器冷凝水排放完毕有蒸汽冒出后微开过滤器尾阀门，缓慢打开进气阀门尾阀门，排放空气管道内的冷凝水，冷凝水排放完毕后缓慢打开进气阀门，使得蒸汽慢慢进入罐体。
（5）、微开发酵罐排气气阀门，缓慢将发酵罐内的冷空气排放出去，在空消的整个过程中，控制发酵罐排气阀门，使得发酵罐排气阀门有少量蒸汽流通。
电加热棒
（6）、当控制柜温度显示接近123℃，发酵罐罐内压力接近0.12Mpa时缓慢打开接种管道尾端，将接种管道内冷凝水排放完毕后保证尾端有少量蒸汽冒出保证蒸汽流通。
（7）、当温度达到123℃，发酵罐压力达到0.12Mpa时控制柜开始时间倒计时，屏幕上显示温度和倒计时时间，当倒计时时间为0时，控制柜自动报警，此时空消结束。
（8）、空消结束后，关闭发酵罐加热棒，关闭夹套进过滤器阀门，发酵罐进气阀门，发酵罐接种阀门，接种管道尾端阀门。微开发酵罐排气阀门、夹套排气阀门，发酵罐进气阀门尾阀门，使得夹套，发酵罐内，过滤器的压力慢慢下降，当过滤器压力即将卸完时，打开空压机（打气泵），使得空气流通过滤器，通过过滤器的空气在发酵罐进气阀门尾阀门排放掉，流过过滤器的空气对滤芯吹30min，使得吹出的空气无水分后备用。
（四）、投料
投料前检查发酵罐接种阀门和发酵罐进气阀门是否关闭，确认发酵罐内压力为0。将发酵罐口打开，将配好的培养基由罐口倒入或用泵打入发酵罐中，加入泡敌，然后加水定容，液面高度以高于视镜下边缘10厘米为宜。拧紧发酵罐口盖子，以防漏气。
（五）、发酵罐实消
1、投料结束后，打开夹套排气阀门和发酵罐排气阀门，启动电源，按下“灭菌”键，此时进
入灭菌状态。
2、当温度升到100℃夹套有蒸汽冒出时关闭夹套排气阀门，发酵罐排气阀门微开，整个发酵罐实消过程中控制发酵罐排气阀门的开度，保证发酵罐罐内冷空气排净并保证有蒸汽流通。
3、当控制柜显示屏幕上显示温度123℃，压力表压力0.12 Mpa时控制柜自动倒计时，屏幕上可显示发酵罐温度和倒计时时间，当时间倒计时为0时，控制柜自动报警，打开夹套排气阀门，发酵罐排气阀门，使得夹套和发酵罐压力缓慢下降（发酵罐压力不能掉零）此时发酵罐灭菌结束。
注意：计时开始时和灭菌即将结束时需要对发酵罐进行排料操作，微开接种阀门，有少量气、料排出即可，每次排料时间3-5 min 。排料的目的一是排出阀门处的生料，二是对阀门管路进行灭菌。
(六)、培养基冷却
培养基冷却是将灭菌结束后的培养基由123℃ 降至25℃的过程。可采用两种冷却方法：一
是通冷水，利用循环冷却水进行冷却降温。二是发酵罐通气，在培养料灭菌最后一次放料后，微关发酵罐进气阀门尾阀门，同时微开发酵罐进气阀门，启动空压机，操作缓慢进行，使得之前通过过滤器的无菌空气通入发酵罐内。控制发酵罐排气阀门使发酵罐压力控制在0.04mpa
(七)、发酵罐接种
发酵罐接种在发酵罐的整个操作过程中尤为重要，接种操作直接影响到后期发酵罐培养工作。接种前要准备好火圈（棉花缠紧，用纱布套上）、火机、95%工业酒精、75%消毒酒精、手套、湿抹布。具体操作如下：
1、关闭门窗以及通风设施，用消毒液喷洒后开启臭氧机灭菌，进行环境、工具工作服消毒，屏风围挡。
2、接种人员在环境消毒后进入现场，着工作服、戴口罩、卫生帽，将火圈用酒精浸泡后套入发酵罐罐口。
3、接种人员用75%消毒酒精擦拭双手以及种子瓶口后，点燃火圈。
4、火圈点燃后，关闭发酵罐进气阀门，打开发酵罐进气尾阀门，微开发酵罐排气阀门，当发酵罐罐压降至0.01Mpa以下时，关闭发酵罐排气阀门，在火焰的保护下打开发酵罐罐口，发酵罐罐口盖子移至火焰上方。
5、接种人员将种子瓶移至火焰处，一手拿瓶一手拿镊子在火焰的保护下将瓶口的棉塞旋下，棉塞要在火焰的保护区内，用火焰对种子瓶口消毒后，稳、准、快地把种子培养液倒入发酵罐内，接种量10%。在火焰的保护下将棉塞塞住瓶口，移出火焰保护区，种子瓶备检。
6、在火焰的保护下迅速将发酵罐口盖子拧紧，迅速打开发酵罐进气阀门，关闭发酵罐进气尾阀门，使得发酵罐压迅速上升。湿抹布将火焰扑灭。收起火圈，去除屏风。
注意：整个接种过程禁止人员走动，禁止说话，防止空气流动，穿戴好防护用品，整个过程要快速有序。
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