北大医学部激光扫描共焦显微镜与流式细胞总结
激光扫描共焦显微镜与流式细胞总结
一、根据激光扫描共聚焦显微镜（Confocal）的工作原理，说明：
1、为什么Confocal能够逐层采集荧光样品的一系列高清晰光学切片？
Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即为共焦点，被探测点所在的平面即为共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。 2、如何实现时间动态程序监测？
将样品固定在同一个观察视野，利用动态时间程序软件，按照一定的时间间隔，自动采集某时间段内该视野的一系列图像，并定量测定相关参数的随着时间的变化。特点：快速跟踪毫秒级变化。具体操作如下：1）在显微镜下到活细胞；
2）调节扫描状态，获得满意图像；
3）把Mode改成XYT；
4）设定加药时间，加药后观察时间；
5）开始程序，自动完成程序。
二、如何利用Confocal实时监测细胞内钙离子变化？
（1）将细胞种在共焦小皿中，
（2）将用FLuo3等银光染料标记好样本，在显微镜下到合适的细胞。
（3）确定采集图像的条件，包括针孔的大小、光电倍增管的增益、滤片系统的选择、扫描速度和扫描密度等，扫描速度和扫描密度要精心选择，它直接影响采样频率，即会影响测量结果。
（4）根据细胞种类和所加的药物等实验要求，确定采集频率，即采集每一幅图像的间隔时间。当需要采样频率较高时，采集每一幅图像的时间间隔可设定为零，此时采样频率的快慢取决于扫描速度和扫描密度。如果仍然不能满足Ca2＋快速变化的要求，应加快扫描速度和减少扫描密度，或采用线扫描。然后根据扫描的总时程，确定共需采集多少幅图像。
（5）开始采集图像，加药前采集1分钟作为静息水平对照，加药后继续扫描。程序设定加药的等待时间。
（6）采集图像之后或采集之前，勾画感兴趣的细胞或细胞内某个区域（核周、胞浆、胞核或突起等），计算机会描绘出时间－荧光强度曲线。
三、影响所采集图像荧光强度的参数主要有哪些？
1、物镜性能：放大倍数、数值孔径、分辨率、景深-焦点深度、镜像高度、物镜工作距离 、视野范围；
2、激发光波长/强度；
3、发射波长范围/强度；
4、检测器灵敏度；
5、Pinhole大小；
6、聚焦程度；
7、其他（可以不答）：甘油、盖片数等。
四、在Hoechst 33258、DAPI、PI（propidium iodide，碘化丙叮）、AO （acridine orange，吖啶橙）这四种核酸探针中
（1）要特意地标记活细胞内的DNA，应该选择哪种核酸探针？
Hoechst 33258（定位于细胞核）、AO
（2）若要特意地标记固定（死）的细胞内的DNA可选择哪种核酸探针？
DAPI（半通透细胞，定位于细胞核）、PI
1、物镜的数值孔径及意义。
（1）物镜的数值孔径：是物镜与样品之间介质的折射率(n)和1/2孔径角（u）的正弦值的乘积。
NA=n×Sin u
（2）意义：数值孔径是物镜最重要的参数之一，它直接影响物镜的分辨率和物镜的镜像亮度。NA越大越好。
2、显微镜有几种性能指标？了解各种性能指标的意义。
(1)数值孔径：物镜的最重要的参数之一，直接影响物镜的分辨率和物镜的镜像亮度。
(2)分辨率：区分物平面两个点间最小距离为分辨距离即分辨率。它代
表分辨微细结构的本领。
(3)放大率：放大率等于物镜放大率乘以目镜放大率。
(4)景深-焦点深度：景深表示清晰的像平面所能对应物平面前后空间的深度（或指焦点与样品上某点相一致时，能看清这一点及其上下两侧的结构）。那么，清晰部分的厚度即为景深，也称为焦点深度。
(5)镜像亮度：显微图像亮度。
(6)物镜工作距离：物镜工作距离越长，NA越小。
(7)视野范围：镜下看到的目镜光阑所围的圆，其直径为视野宽度。
3、按校正像差分类，物镜有几种等级标识？每一种标识的意义.
（1）消差物镜：校正了球差，彗差和二种光的位置差。物镜外壳没有特殊标记。
（2
：
在消误差镜的基础上还矫正了像散和场曲，像面平坦。物镜外壳标有
（3）半平场消误差镜误差经，接近平场消误差镜。外壳刻有（4
：差的校正程度介于平场消误差镜与平场复消误差镜之间。刻有此类物镜通常作为观察荧光的物镜来使用。
（5）平场复消误差这种物镜成像最佳，数值孔径也较同倍率物镜大。外壳刻有
4、荧光显微镜光路中的滤片有几种？各自在荧光光路中的作用。
（1）激发滤片：位于光源和物镜之间，作用是选择适于特定荧光物
质的激发波长。
（2）二光分光镜：它的放置方向与激发光的方向呈45，位于激发光滤片和发射光滤片之间，具有特征值M（Leica显微镜用RKP表示）。波长短于M的光被反射，波长大于M的光可通过，也就是说它对激发光具有高反射率，而对激发出的荧光具有高透过率，它是分离激发光（短波长）和发射荧光（长波长）的一个重要组件。
（3
）阻挡滤片：位于目镜之前。其作用是进一步使发射荧光与激发光分离，以获得更纯的发射荧光。
模拟图像与数字图像的区别，数字图像的特点。（理解即可）
（1）模拟图像
a. 定义：图像是用各种观测系统以不同形式和手段观测客观世界而获得的，可以直接或间接作用于人眼并进而产生视知觉的实体。
b. 存在形式：常见的各种照片、图片、海报、广告画等均属模拟图像.医学中的图像包括组织胚胎学、病理学、细胞学、遗传学、分子生物学、放射学、超声、X线、CT、磁共振、PET、电子显微术和热像等图像。如果把图形（如心电图、脑电图等）都包括进去，则几乎医学基础研究和临床诊断就离不开图像（形）了。（这个记住几个就成）
c. 函数表示：f (x,y,λ,t)
x,y ——表示图像在某点的坐标
f (x,y) ——表示图像在(x,y)点的强度（亮度）
（2）数字图像
a. 定义：将模拟图像变换成为计算机能够处理的数字矩阵或数组被称为数字图像。
b. 存在形式：必须以数字格式存储
c. 函数表示：
数字图像的特点：便于计算机处理分析；图像损失低；抽象性强。（不确定）
2. 图像处理与分析的主要内容：
①改善图像的质量-----“图像→图像”
模糊图像经图像增强、消除噪声清晰图像
使图像的质量得到改善
图像处理：从图像到图像的变换。以完善图像的视觉效果为目标
②描述图像的目标特征-----“图像→描述”
目标：把对图像中感兴趣的某些区域称为目标。
图像经图像分割获取目标对图像中
并进行特征参数的测量某些特征的描述
图像分析：从图像到特征描述的变换。着重对图像中感兴趣的目标进行特征提取③三维结构的重建-----“描述→图像”
对一个立体结构按一定的方向，一定的间隔，连续切出二维断面，通过对二维图像的描述，再返推出三维图像。
CT就是图像重建处理的典型应用实例
3.．图像分析系统硬件组成—主要包括四个部分：
①输入系统
激光修复机主要包括：显微镜
宏观器CCD摄像头
解剖镜(小鼠的椎骨、牙)
CCD（Charge coupled Device ）电荷耦合器件
CCD 可以将照射在其上的光信号转换为对应的电信号。
②图像采集系统--图像采集卡
③计算机
④输出系统：主要包括：显示器、打印机、显微照相、软盘、硬盘、光盘、U盘等
4.图像数字化原理主要包括什么？如何计算图象的大小？
（1）图像数字化就是指把一幅灰度随空间位置作连续变化的图像变换成一幅离散的数字图像的过程。包括两个方面：空间采样、灰度量化空间采样的定义: 把一幅连续图像在空间上用M*N个样本点表示的
方法称为空间采样。灰度量化定义：将灰度从黑到白分成若干等级，这种方法称为灰度量化。
（2）不知道啊是不是就是M*N？
5.掌握霍夫曼（Huffman）编码（一定要掌握）
1）基本思想：通过减少编码冗余来达到压缩的目的。
统计符号的出现概率，
建立概率统计表.
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